离子液体介质对酶促糖苷酯合成反应的影响
目 录
1 引言 1
1.1 离子液体 1
1.2 虎杖苷 2
1.3 非水介质中脂肪酶催化反应 2
1.4 离子液体中脂肪酶催化酯类合成 4
1.5 本研究的内容、目的意义 4
2 离子液体介质中酶促虎杖苷酰化反应 5
2.1 实验材料 5
2.2 主要仪器设备 6
2.3 实验方法 6
3 结果与讨论 9
3.1 反应介质对酶促虎杖苷酰化反应的影响 9
3.2 底物摩尔比对酶促虎杖苷酰化反应的影响 10
3.3 不同温度对酶促虎杖苷酰化反应的影响 11
3.4 不同反应介质中酶促虎杖苷酰化反应的活化能比较 12
3.5 不同反应介质中酶促虎杖苷酰化反应的动力学探索 13
3.6 离子液体对酶促虎杖苷酰化反应的影响 15
结 论 17
参 考 文 献 18
附录 虎杖苷与十一碳烯酸乙烯酯酶促酰化反应色谱图 20
致 谢 21
1 引言
酶作为一种高效生物催化剂，与化学催化剂相比，具有反应条件温和、反应过程简单，同时具有高度的化学选择性、立体选择性、区域选择性的优点，因此受到人们的普遍关注并被广泛地应用于生物、化学合成等诸多领域。传统观念认为，酶只在水溶液中催化水溶性底物转化，然而随着酶应用技术研究的深入，发现酶在有机溶剂中具有极高的热稳定性和较高的催化活性。
在不断的研究中发现，酶的活性和选择性在非水介质中与在水中的差别很大。自1984 年Zaks 和Klibanov等[1]开创非水介质中酶促反应以来， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
因酶在有机溶剂中的热稳定性与储存稳定性与在水中相比有明显提高，产物的分离与纯化与在水中相比更容易，使有些反应过程的热力学平衡向所期望的方向移动，并且能够抑制微生物的污染，因此酶在有机溶剂中反应特性的研究和应用等受到更多的关注。
1.1 离子液体
离子液体是指在室温或接近室温下呈现液态的、完全由阴阳离子所组成盐，也称为低温熔融盐。离子液体作为离子化合物，其熔点较低的主要原因是因其结构中某些取代基的不对称性使离子不能规则地堆积成晶体所致。一般按阴阳离子的组成可分为三大类：有机阳离子-有机阴离子；有机阳离子-无机阴离子；无机阳离子-无机阴离子。离子液体一般由体积比较大、对称性较低的阳离子和有机或无机阴离子组成，常见的阳离子有季铵盐离子、季鏻盐离子、咪唑盐离子和吡咯盐离子等，阴离子有卤素离子、四氟硼酸根离子、六氟磷酸根离子等[2]。
离子液体（Ionic liquids, ILs）作为 21 世纪最具潜力的新型反应介质，常温呈液态，具有饱和蒸气压小、不可燃性、疏水性、可重塑性以及良好的热力学稳定性等性质[3]。近年来，离子液体在提高酶的热稳定性、反应选择性和底物溶解性等方面表现出优越的介质特性。特别是，离子液体为介质的酶促酯类合成已成为生物有机合成领域的前沿方向。
氨基酸是最大的天然手性池之一，无毒且方便易得，由于其既含有氨基又含有羧基，因此既可作为离子液体的阴离子又可作为其阳离子。因氨基酸类离子液体具有手性、生物降解性、低毒性及高生物相容性，该类离子液体已成为新型离子液体研究开发方向。而胆碱氢氧化物是一种无毒的强碱，容易与各种酸进行中和反应，因此胆碱-氨基酸离子液体可通过简单的中和反应制得。本文采用的就是以氨基酸提供阴离子胆为阳离子合成离子液体。
1.2 虎杖苷
虎杖苷（Polydatin，PD），亦称为白黎芦醇苷，是从蓼科蓼属虎杖的干燥根茎中提取的第4种单体，故又名虎杖结晶4号。它是白藜芦醇与葡萄糖结合的产物，均属于芪类化合物，即羟基二苯乙烯类化合物，化学名称为3，4，5-三羟基芪-3-β-单-D-葡萄糖苷，结构有顺反式两种（图1）[4]。虎杖苷在植物中分布广，含量高，具有较强的生物活性。现代药理学研究表明，虎杖苷对心肌细胞、血管平滑肌细胞（VSMC）、抗血小板聚集、改善微循环等有明显作用，此外还能减轻多种因素造成的组织器官损伤，具有保护肝细胞，降血脂及抗脂质过氧化等作用。近十年来，国内外学者对虎杖苷的化学结构、性质、提取分离、药理作用以及含量测定等做了许多研究，但在生物体内药代动力学研究还知之甚少。
图1 虎杖苷的化学结构
1.3 非水介质中脂肪酶催化反应
1.3.1 用于酰化反应的脂肪酶
脂肪酶是一类特殊酯键水解酶，能够催化由不同底物组成的水解和合成反应。它将三酰甘油酯水解成为甘油和游离脂肪酸，而在有机相中，脂肪酶则催化酯化、酯交换以及转酯化反应。脂肪酶催化短链脂肪酸酯反应具有条件温和、催化专一性强、催化效率高等优点。作为有机合成中重要的生物催化剂，脂肪酶已被广泛用于油脂、食品、香料化妆品、医药、农药等有机合成领域。脂肪酶在微生物界分布很广，大约65个属微生物可产脂肪酶，其中细菌有28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其它真菌23个属，但实际上微生物脂肪酶分布远远超过这个数目[5]。
1.3.2 非水介质的影响
目前发现适用于酶催化的非水介质体系主要有：有机溶剂体系（Organic solvents）、混合有机溶剂体系（Co-solvent mixtures）、离子液体（Ionic liquids，ILs）、超临界流体（Supercritical fluids）、气体（Gases）等[6]。研究表明，非水相酶催化的兴起和发展极大地拓宽了酶的应用领域。与水相催化相比，在非水介质中的酶催化有如下优点[7-9]：（1）可增强非极性底物的溶解度及增强底物浓度，从而提高反应速度。（2）可进行在水相中不能进行的反应（如本文所研究的酯合成），以及减少因水引起的副反应。（3）可改变热力学平衡，有利于产物的生成。（4）可提高酶的稳定性，且有利于酶与产物的分离及酶的循环使用。
然而有机溶剂易使酶失活或活力降低，且酶在有机相中溶解度较小，反应受传质扩散的限制大，大部分酶在非水相中的反应速度远远低于在水相中的反应，非水相催化的应用受到了极大的限制。因此如何提高非水相酶的反应速度是扩大工业应用的关键。
在非水介质中，脂肪酶处于与水极不相同的环境，其催化反应时作用在亲水-疏水界面层，催化部位位于分子内部，表面被相对疏水的氨基酸残基形成的α-螺旋盖状结构覆盖，从而对三联体（Ser-His-Asp或Ser-His-Glu）催化部分起保护作用[10]。通过界面活化可提高催化部位附近的疏水性，导致α-螺旋再定向，以暴露出催化部位[11]。
1.3.3 水活度的影响
在非水相酶促反应中，脂肪酶的催化活性与反应体系的含水量活水活度密切相关。总体来讲，水在酶促反应中有着正反两方面的作用：在正的方面，绝干的酶是不具有催化活性的，因为水分子通过氢键、疏水键、范德华力等非共价键相互作用来维持酶分子具有催化活性所必需的构象。脂肪酶催化活性所必需的最少水量即为必需水，由于这层微观的必需水层的存在，使得酶在相对宏观的非水相中也具有催化活性。由此可见，水有助于保持脂肪酶结构的完整性、活性中心的极性和酶蛋白的稳定性；而在反的方面，在有水生成的可逆反应(如酯化反应)中，水的存在不利于该反应的热力学平衡向酯化方向移动。此外，水与大部分脂肪酶的失活作用有关，尤其是酶的“热失活”。很多研究表明在非水相酶促反应中存在一“最适含水量”。因为只有在最适水量时，蛋白质结构的动力学刚性和热力学稳定性达到最佳平衡，酶表现出最大活力，此最适水量也称为“必需水”[12]。
1 引言 1
1.1 离子液体 1
1.2 虎杖苷 2
1.3 非水介质中脂肪酶催化反应 2
1.4 离子液体中脂肪酶催化酯类合成 4
1.5 本研究的内容、目的意义 4
2 离子液体介质中酶促虎杖苷酰化反应 5
2.1 实验材料 5
2.2 主要仪器设备 6
2.3 实验方法 6
3 结果与讨论 9
3.1 反应介质对酶促虎杖苷酰化反应的影响 9
3.2 底物摩尔比对酶促虎杖苷酰化反应的影响 10
3.3 不同温度对酶促虎杖苷酰化反应的影响 11
3.4 不同反应介质中酶促虎杖苷酰化反应的活化能比较 12
3.5 不同反应介质中酶促虎杖苷酰化反应的动力学探索 13
3.6 离子液体对酶促虎杖苷酰化反应的影响 15
结 论 17
参 考 文 献 18
附录 虎杖苷与十一碳烯酸乙烯酯酶促酰化反应色谱图 20
致 谢 21
1 引言
酶作为一种高效生物催化剂，与化学催化剂相比，具有反应条件温和、反应过程简单，同时具有高度的化学选择性、立体选择性、区域选择性的优点，因此受到人们的普遍关注并被广泛地应用于生物、化学合成等诸多领域。传统观念认为，酶只在水溶液中催化水溶性底物转化，然而随着酶应用技术研究的深入，发现酶在有机溶剂中具有极高的热稳定性和较高的催化活性。
在不断的研究中发现，酶的活性和选择性在非水介质中与在水中的差别很大。自1984 年Zaks 和Klibanov等[1]开创非水介质中酶促反应以来， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
因酶在有机溶剂中的热稳定性与储存稳定性与在水中相比有明显提高，产物的分离与纯化与在水中相比更容易，使有些反应过程的热力学平衡向所期望的方向移动，并且能够抑制微生物的污染，因此酶在有机溶剂中反应特性的研究和应用等受到更多的关注。
1.1 离子液体
离子液体是指在室温或接近室温下呈现液态的、完全由阴阳离子所组成盐，也称为低温熔融盐。离子液体作为离子化合物，其熔点较低的主要原因是因其结构中某些取代基的不对称性使离子不能规则地堆积成晶体所致。一般按阴阳离子的组成可分为三大类：有机阳离子-有机阴离子；有机阳离子-无机阴离子；无机阳离子-无机阴离子。离子液体一般由体积比较大、对称性较低的阳离子和有机或无机阴离子组成，常见的阳离子有季铵盐离子、季鏻盐离子、咪唑盐离子和吡咯盐离子等，阴离子有卤素离子、四氟硼酸根离子、六氟磷酸根离子等[2]。
离子液体（Ionic liquids, ILs）作为 21 世纪最具潜力的新型反应介质，常温呈液态，具有饱和蒸气压小、不可燃性、疏水性、可重塑性以及良好的热力学稳定性等性质[3]。近年来，离子液体在提高酶的热稳定性、反应选择性和底物溶解性等方面表现出优越的介质特性。特别是，离子液体为介质的酶促酯类合成已成为生物有机合成领域的前沿方向。
氨基酸是最大的天然手性池之一，无毒且方便易得，由于其既含有氨基又含有羧基，因此既可作为离子液体的阴离子又可作为其阳离子。因氨基酸类离子液体具有手性、生物降解性、低毒性及高生物相容性，该类离子液体已成为新型离子液体研究开发方向。而胆碱氢氧化物是一种无毒的强碱，容易与各种酸进行中和反应，因此胆碱-氨基酸离子液体可通过简单的中和反应制得。本文采用的就是以氨基酸提供阴离子胆为阳离子合成离子液体。
1.2 虎杖苷
虎杖苷（Polydatin，PD），亦称为白黎芦醇苷，是从蓼科蓼属虎杖的干燥根茎中提取的第4种单体，故又名虎杖结晶4号。它是白藜芦醇与葡萄糖结合的产物，均属于芪类化合物，即羟基二苯乙烯类化合物，化学名称为3，4，5-三羟基芪-3-β-单-D-葡萄糖苷，结构有顺反式两种（图1）[4]。虎杖苷在植物中分布广，含量高，具有较强的生物活性。现代药理学研究表明，虎杖苷对心肌细胞、血管平滑肌细胞（VSMC）、抗血小板聚集、改善微循环等有明显作用，此外还能减轻多种因素造成的组织器官损伤，具有保护肝细胞，降血脂及抗脂质过氧化等作用。近十年来，国内外学者对虎杖苷的化学结构、性质、提取分离、药理作用以及含量测定等做了许多研究，但在生物体内药代动力学研究还知之甚少。
图1 虎杖苷的化学结构
1.3 非水介质中脂肪酶催化反应
1.3.1 用于酰化反应的脂肪酶
脂肪酶是一类特殊酯键水解酶，能够催化由不同底物组成的水解和合成反应。它将三酰甘油酯水解成为甘油和游离脂肪酸，而在有机相中，脂肪酶则催化酯化、酯交换以及转酯化反应。脂肪酶催化短链脂肪酸酯反应具有条件温和、催化专一性强、催化效率高等优点。作为有机合成中重要的生物催化剂，脂肪酶已被广泛用于油脂、食品、香料化妆品、医药、农药等有机合成领域。脂肪酶在微生物界分布很广，大约65个属微生物可产脂肪酶，其中细菌有28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其它真菌23个属，但实际上微生物脂肪酶分布远远超过这个数目[5]。
1.3.2 非水介质的影响
目前发现适用于酶催化的非水介质体系主要有：有机溶剂体系（Organic solvents）、混合有机溶剂体系（Co-solvent mixtures）、离子液体（Ionic liquids，ILs）、超临界流体（Supercritical fluids）、气体（Gases）等[6]。研究表明，非水相酶催化的兴起和发展极大地拓宽了酶的应用领域。与水相催化相比，在非水介质中的酶催化有如下优点[7-9]：（1）可增强非极性底物的溶解度及增强底物浓度，从而提高反应速度。（2）可进行在水相中不能进行的反应（如本文所研究的酯合成），以及减少因水引起的副反应。（3）可改变热力学平衡，有利于产物的生成。（4）可提高酶的稳定性，且有利于酶与产物的分离及酶的循环使用。
然而有机溶剂易使酶失活或活力降低，且酶在有机相中溶解度较小，反应受传质扩散的限制大，大部分酶在非水相中的反应速度远远低于在水相中的反应，非水相催化的应用受到了极大的限制。因此如何提高非水相酶的反应速度是扩大工业应用的关键。
在非水介质中，脂肪酶处于与水极不相同的环境，其催化反应时作用在亲水-疏水界面层，催化部位位于分子内部，表面被相对疏水的氨基酸残基形成的α-螺旋盖状结构覆盖，从而对三联体（Ser-His-Asp或Ser-His-Glu）催化部分起保护作用[10]。通过界面活化可提高催化部位附近的疏水性，导致α-螺旋再定向，以暴露出催化部位[11]。
1.3.3 水活度的影响
在非水相酶促反应中，脂肪酶的催化活性与反应体系的含水量活水活度密切相关。总体来讲，水在酶促反应中有着正反两方面的作用：在正的方面，绝干的酶是不具有催化活性的，因为水分子通过氢键、疏水键、范德华力等非共价键相互作用来维持酶分子具有催化活性所必需的构象。脂肪酶催化活性所必需的最少水量即为必需水，由于这层微观的必需水层的存在，使得酶在相对宏观的非水相中也具有催化活性。由此可见，水有助于保持脂肪酶结构的完整性、活性中心的极性和酶蛋白的稳定性；而在反的方面，在有水生成的可逆反应(如酯化反应)中，水的存在不利于该反应的热力学平衡向酯化方向移动。此外，水与大部分脂肪酶的失活作用有关，尤其是酶的“热失活”。很多研究表明在非水相酶促反应中存在一“最适含水量”。因为只有在最适水量时，蛋白质结构的动力学刚性和热力学稳定性达到最佳平衡，酶表现出最大活力，此最适水量也称为“必需水”[12]。
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