微粉化坎利酮微生物羟基化研究
目 录
1 引言 1
1.1 11α-羟基坎利酮的医药用途 1
1.2 11α-羟基坎利酮的市场 2
1.3 国内外甾体药物的研究进展 2
1.4 增加药物溶解度的原因及方法 3
1.5 底物微粉化的意义 5
1.6 甾体微粉化的方法 5
1.7 本课题研究的内容和意义 6
2 材料与方法 6
2.1 菌种与培养基 6
2.2 试剂与材料 6
2.3 仪器与设备 7
2.4 实验方法 7
3 结果与讨论 11
3.1 菌种检测 11
3.2 酵母膏浓度水平实验结果 12
3.3 微粉化粒径对坎利酮微生物转化的影响 13
3.4 培养基初始pH对转化的影响 14
3.5 接种量对转化的影响 15
3.6 摇床转速对转化的影响 16
3.7 温度对转化的影响 17
3.8 坎利酮微生物转化条件的优化 17
结论 20
致谢 21
参考文献 22
1 引言
坎利酮（Canrenone）是一种甾体激素类的心血管药物，临床上用作醛固酮拮抗剂来治疗心血管疾病。虽然坎利酮对病症的治疗效果明显，但是副作用也比较大，有致死的危险。治疗心血管疾病的药物依普利酮副作用比坎利酮要小，坎利酮的羟基化产物11α-羟基坎利酮（11-alpha-Hydroxycarvenone）是合成依普利酮的关键医药中间体。
1.1 11α-羟基坎利酮的医药用途
11 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
α-羟基坎利酮（11-alpha-Hydroxycarvenone）是一种甾体化合物，主要用途是合成选择性醛固酮受体拮抗剂依普利酮的医药中间体，从而治疗心血管疾病。11α-羟基坎利酮的前体化合物坎利酮（Canrenone），在临床上主要用作非选择性醛固酮受体拮抗剂来治疗心血管疾病。与非选择性受体拮抗剂相比，选择性受体拮抗剂比非选择性的更有效。此外，临床研究发现，坎利酮会负面影响地高辛的定量检测结果，从而导致使用地高辛药物的心脏病患者用药过量而死，这是十分不利且致命死亡缺点。基于以上原因，人们开始寻求坎利酮的替代品。研究发现，坎利酮发生硝基化、羟基化等反应后得到的衍生物，在合成药物之后，不仅疗效与坎利酮相比有所增强，而且，副作用也会相应的减少，这解决了坎利酮的致命缺陷。
经过研究发现，目前发现的坎利酮的衍生化类型中，由11α-羟基坎利酮可以得到其他一系列的坎利酮衍生物（图1），这为坎利酮的衍生物转化提供了方便。因此在坎利酮合成依普利酮的过程中，坎利酮微生物转化11α-羟基坎利酮是第一步，也是人们重点攻克的难点。
图 1 由坎利酮合成依普利酮的工艺[1]
1.2 11α-羟基坎利酮的市场
从1998年起，每年的10月8日是我国高血压日，每年的这一天，有关部门会大力宣传高血压的危害，呼吁人民群众关注心血管疾病，以达到防治高血压的目标。因此，随着心血管疾病相关知识的普及，愈来愈多的患者会及时发现自己的患病，并主动前往医院治疗，这是心血管疾病药物能快速发展的前提。其中依普利酮的需求量急速增加，是因为，选择性醛固酮受体阻断圳依普利酮可以有效控制轻中度高血压，有良好的耐受性，不会在多次用药后就渐渐失去药效。?
醛固酮是存在于肾素－血管紧张素－醛固酮系统（ＲＡＡＳ）中的一种重要成分，在人体心血管系统的调节中具有重要的作用[2]。依普利酮阻断醛固酮受体的作用具有相对的选择性，主要作用于肾上腺的醛甾酮受体，后者可调节多重因子如血管紧张素ｌＩ和非ＲＡＡＳ介导的促肾上腺皮质激素（ＡＣＴＨ）。醛固酮与上皮的（如肾脏）和非上皮（如心脏、血管和大脑）组织中的盐皮质激素受体结合，通过诱导产生钠的重吸收以及其他机制可引起血压升高[3]。研究显示，依普利酮可引起持续的血浆肾素和血清醛固酮的升高，同时又阻断醛固酮的反馈调节作用，但血浆中肾素活性的增加和体循环中醛固酮水平的升高，并不会抵消本品对血压的控制作用。
11α-羟基化坎利酮作为合成依普利酮的医药中间，也变得十分紧缺。目前11α-羟基化坎利酮的市场价格为10000元/kg。
1.3 国内外甾体药物的研究进展
目前，甾体药物包括皮质激素类药物、性激素类药物、麻醉类药物和治疗心脑血管疾病的药物。甾体药物用途广泛，对疾病的治愈效果也很好，具有十分远大的发展前景和市场。
甾体是一类结构复杂、具有重要功能的医药中间体，由于甾体结构极为复杂,以目前的科技水平来说，利用全化学合成的方法大规模生产不仅工艺水平达不到,成本也十分高昂。所以目前工业生产上通常以具有甾体母核结构的天然产物为原料，采用半合成的方法改造后制得。化学合成法不仅步骤复杂，而且除了需要的产物之外，还有很多其他的副产物，要将人们想要获得的产物从那些种类繁多，成分又复杂的副产物中分离提纯，不仅后续工艺复杂，成本也变得高昂。诸多不利于工业化生产的因素， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
阻碍了甾体药物的发展。近年来，随着细胞工程的发展，有关甾体药物的研究也获得了突破。研究者发现，某些霉菌可以利用自身生产的酶，来将坎利酮转化为11α-羟基坎利酮。这使得甾体药物从传统的化学合成法转向新兴的微生物合成法。
甾体微生物转化是利用微生物酶对甾体底物的某一部位进行特定的化学反应来获得一定的产物。微生物转化是利用生物酶催化的专一特性，使酶源微生物所产生的酶对外源性底物的某一特定部位（基团）产生作用，使底物分子结构变化为相类似的另一种化合物。微生物转化甾体的实质是微生物细胞色素P450酶系催化与调控的生化反应[4]。
但是，与化学合成法所需的高温高压条件相比，微生物转化法虽然具有选择性高、转化率高、反应条件温和的优势，但因为甾体在水中溶解度极低，而导致转化时间较化学法大大延长。通常情况下，转化10g/L的底物需要48h以上才能转化完全。
1.4 增加药物溶解度的原因及方法
1.4.1 药物溶解度与分子结构?
药物在溶剂中的溶解度不只是由药物分子本身决定的，而是药物分子与溶剂分子之间一起相互作用、共同决定的结果。如果药物分子和药物分子之间的相互作用力，大于药物分子与溶剂分子间的相互作用力，那么，药物的溶解度就小；反之，如果药物分子和药物分子之间的相互作用力，小于药物分子与溶剂分子间的相互作用力，则溶解度就大。
氢键与药物溶解度的大小有很大的关系。在极性溶剂中，如果药物分子与溶剂分子相互之间形成氢键，那么药物分子在极性溶剂中的溶解度就会增大。如果药物分子形成分子内氢键，那么药物分子在极性溶剂中的溶解度会减小，同时，药物分子在非极性溶剂中的溶解度会增大。
有机弱酸弱碱药物可以利用制成可溶性盐的方式来增加其在溶剂中的溶解度。将含碱性基团的药物，例如生物碱，加酸制成盐类，可增加其在水中溶解度；将酸性药物，加碱制成盐类，可增加其在水中溶解度。
1.4.2 溶剂化作用与水合作用??
3.5 接种量对转化的影响
改变孢子悬浮液的接种量可以轻微地改变孢子在培养基中的浓度，从而改变菌丝体在转化培养基中的分布形态和转化体系中物质的传输，对转化产生影响，另外，接种量也能够影响微生物的生长量，间接对转化产生影响[10]。为了考察接种量对坎利酮微生物转化的影响，在其他条件不变只改变接种量的情况下，利用赭曲霉NG0216对坎利酮进行微生物转化，得到了转化产物的粗品。对粗品进行TLC分析，结果如图（图8）
1 引言 1
1.1 11α-羟基坎利酮的医药用途 1
1.2 11α-羟基坎利酮的市场 2
1.3 国内外甾体药物的研究进展 2
1.4 增加药物溶解度的原因及方法 3
1.5 底物微粉化的意义 5
1.6 甾体微粉化的方法 5
1.7 本课题研究的内容和意义 6
2 材料与方法 6
2.1 菌种与培养基 6
2.2 试剂与材料 6
2.3 仪器与设备 7
2.4 实验方法 7
3 结果与讨论 11
3.1 菌种检测 11
3.2 酵母膏浓度水平实验结果 12
3.3 微粉化粒径对坎利酮微生物转化的影响 13
3.4 培养基初始pH对转化的影响 14
3.5 接种量对转化的影响 15
3.6 摇床转速对转化的影响 16
3.7 温度对转化的影响 17
3.8 坎利酮微生物转化条件的优化 17
结论 20
致谢 21
参考文献 22
1 引言
坎利酮（Canrenone）是一种甾体激素类的心血管药物，临床上用作醛固酮拮抗剂来治疗心血管疾病。虽然坎利酮对病症的治疗效果明显，但是副作用也比较大，有致死的危险。治疗心血管疾病的药物依普利酮副作用比坎利酮要小，坎利酮的羟基化产物11α-羟基坎利酮（11-alpha-Hydroxycarvenone）是合成依普利酮的关键医药中间体。
1.1 11α-羟基坎利酮的医药用途
11 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
α-羟基坎利酮（11-alpha-Hydroxycarvenone）是一种甾体化合物，主要用途是合成选择性醛固酮受体拮抗剂依普利酮的医药中间体，从而治疗心血管疾病。11α-羟基坎利酮的前体化合物坎利酮（Canrenone），在临床上主要用作非选择性醛固酮受体拮抗剂来治疗心血管疾病。与非选择性受体拮抗剂相比，选择性受体拮抗剂比非选择性的更有效。此外，临床研究发现，坎利酮会负面影响地高辛的定量检测结果，从而导致使用地高辛药物的心脏病患者用药过量而死，这是十分不利且致命死亡缺点。基于以上原因，人们开始寻求坎利酮的替代品。研究发现，坎利酮发生硝基化、羟基化等反应后得到的衍生物，在合成药物之后，不仅疗效与坎利酮相比有所增强，而且，副作用也会相应的减少，这解决了坎利酮的致命缺陷。
经过研究发现，目前发现的坎利酮的衍生化类型中，由11α-羟基坎利酮可以得到其他一系列的坎利酮衍生物（图1），这为坎利酮的衍生物转化提供了方便。因此在坎利酮合成依普利酮的过程中，坎利酮微生物转化11α-羟基坎利酮是第一步，也是人们重点攻克的难点。
图 1 由坎利酮合成依普利酮的工艺[1]
1.2 11α-羟基坎利酮的市场
从1998年起，每年的10月8日是我国高血压日，每年的这一天，有关部门会大力宣传高血压的危害，呼吁人民群众关注心血管疾病，以达到防治高血压的目标。因此，随着心血管疾病相关知识的普及，愈来愈多的患者会及时发现自己的患病，并主动前往医院治疗，这是心血管疾病药物能快速发展的前提。其中依普利酮的需求量急速增加，是因为，选择性醛固酮受体阻断圳依普利酮可以有效控制轻中度高血压，有良好的耐受性，不会在多次用药后就渐渐失去药效。?
醛固酮是存在于肾素－血管紧张素－醛固酮系统（ＲＡＡＳ）中的一种重要成分，在人体心血管系统的调节中具有重要的作用[2]。依普利酮阻断醛固酮受体的作用具有相对的选择性，主要作用于肾上腺的醛甾酮受体，后者可调节多重因子如血管紧张素ｌＩ和非ＲＡＡＳ介导的促肾上腺皮质激素（ＡＣＴＨ）。醛固酮与上皮的（如肾脏）和非上皮（如心脏、血管和大脑）组织中的盐皮质激素受体结合，通过诱导产生钠的重吸收以及其他机制可引起血压升高[3]。研究显示，依普利酮可引起持续的血浆肾素和血清醛固酮的升高，同时又阻断醛固酮的反馈调节作用，但血浆中肾素活性的增加和体循环中醛固酮水平的升高，并不会抵消本品对血压的控制作用。
11α-羟基化坎利酮作为合成依普利酮的医药中间，也变得十分紧缺。目前11α-羟基化坎利酮的市场价格为10000元/kg。
1.3 国内外甾体药物的研究进展
目前，甾体药物包括皮质激素类药物、性激素类药物、麻醉类药物和治疗心脑血管疾病的药物。甾体药物用途广泛，对疾病的治愈效果也很好，具有十分远大的发展前景和市场。
甾体是一类结构复杂、具有重要功能的医药中间体，由于甾体结构极为复杂,以目前的科技水平来说，利用全化学合成的方法大规模生产不仅工艺水平达不到,成本也十分高昂。所以目前工业生产上通常以具有甾体母核结构的天然产物为原料，采用半合成的方法改造后制得。化学合成法不仅步骤复杂，而且除了需要的产物之外，还有很多其他的副产物，要将人们想要获得的产物从那些种类繁多，成分又复杂的副产物中分离提纯，不仅后续工艺复杂，成本也变得高昂。诸多不利于工业化生产的因素， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
阻碍了甾体药物的发展。近年来，随着细胞工程的发展，有关甾体药物的研究也获得了突破。研究者发现，某些霉菌可以利用自身生产的酶，来将坎利酮转化为11α-羟基坎利酮。这使得甾体药物从传统的化学合成法转向新兴的微生物合成法。
甾体微生物转化是利用微生物酶对甾体底物的某一部位进行特定的化学反应来获得一定的产物。微生物转化是利用生物酶催化的专一特性，使酶源微生物所产生的酶对外源性底物的某一特定部位（基团）产生作用，使底物分子结构变化为相类似的另一种化合物。微生物转化甾体的实质是微生物细胞色素P450酶系催化与调控的生化反应[4]。
但是，与化学合成法所需的高温高压条件相比，微生物转化法虽然具有选择性高、转化率高、反应条件温和的优势，但因为甾体在水中溶解度极低，而导致转化时间较化学法大大延长。通常情况下，转化10g/L的底物需要48h以上才能转化完全。
1.4 增加药物溶解度的原因及方法
1.4.1 药物溶解度与分子结构?
药物在溶剂中的溶解度不只是由药物分子本身决定的，而是药物分子与溶剂分子之间一起相互作用、共同决定的结果。如果药物分子和药物分子之间的相互作用力，大于药物分子与溶剂分子间的相互作用力，那么，药物的溶解度就小；反之，如果药物分子和药物分子之间的相互作用力，小于药物分子与溶剂分子间的相互作用力，则溶解度就大。
氢键与药物溶解度的大小有很大的关系。在极性溶剂中，如果药物分子与溶剂分子相互之间形成氢键，那么药物分子在极性溶剂中的溶解度就会增大。如果药物分子形成分子内氢键，那么药物分子在极性溶剂中的溶解度会减小，同时，药物分子在非极性溶剂中的溶解度会增大。
有机弱酸弱碱药物可以利用制成可溶性盐的方式来增加其在溶剂中的溶解度。将含碱性基团的药物，例如生物碱，加酸制成盐类，可增加其在水中溶解度；将酸性药物，加碱制成盐类，可增加其在水中溶解度。
1.4.2 溶剂化作用与水合作用??
3.5 接种量对转化的影响
改变孢子悬浮液的接种量可以轻微地改变孢子在培养基中的浓度，从而改变菌丝体在转化培养基中的分布形态和转化体系中物质的传输，对转化产生影响，另外，接种量也能够影响微生物的生长量，间接对转化产生影响[10]。为了考察接种量对坎利酮微生物转化的影响，在其他条件不变只改变接种量的情况下，利用赭曲霉NG0216对坎利酮进行微生物转化，得到了转化产物的粗品。对粗品进行TLC分析，结果如图（图8）
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