发酵所产抗菌物质中消泡剂的分离
发酵所产抗菌物质中消泡剂的分离 [20200509175752]
摘要：本研究建立了硅胶柱层析两步法去除发酵所产抗菌脂肽中的消泡剂成分，采用高效液相色谱（HPLC）检测抗菌脂肽的含量，薄层色谱-可见光分光光度法定量分析消泡剂中甘油三酯含量，TLC法筛选消泡剂的洗脱流动相。结果表明：使用200-300目的硅胶作为柱层析填料，硅胶的总负载量为12.5mg/g时，采用混合流动相（石油醚：乙酸乙酯：乙酸=20:2:1，体积比）以1ml/min流速进行洗脱，可去除高达97.97%的消泡剂成分；采用100% 的乙醇为洗脱流动相，1ml/min流速进行洗脱可将抗菌脂太解析下来，总回收率达到91.52%，纯度从34.07%提高到93.12%。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
关键字:生物表面活性素；消泡剂；硅胶柱层析；分离纯化
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1材料 4
1.2方法 4
1.2.1抗菌脂肽粗品的制备4
1.2.2大豆油甘油三酯定量分析方法的建立4
1.2.3硅胶柱层析5
1.2.4 硅胶柱层析条件优化5
1.2.5回收率和纯度的计算5
1.2.6数据统计方法 5
2结果与分析5
2.1大豆油甘油三酯薄层色谱法展开剂的选择5
2.2大豆油甘油三酯标准曲线的建立6
2.3洗脱大豆油甘油三酯流动相的选择与验证6
2.4柱层析优化7
2.4.1洗脱surfactin流动相的优化7
2.4.2洗脱流速的优化7
2.4.3上样量的优化8
3讨论 8
致谢9
参考文献9
图1甘油三酯浓度与吸光值之间的关系曲线6
图2 流动相对纯度和回收率的影响7
图3流速对回收率和纯度的影响8
图4上样量对回收率和纯度的影响8
表1不同展开剂的薄层层析结果6
表2甘油三酯洗脱实验7
发酵所产抗菌物质中消泡剂的分离
引言
抗菌脂肽一般是由革兰氏阳性芽孢杆菌产生的一类代谢产物，是抗菌肽中的一小类，由亲水的肽链和亲油的脂肪烃链两部分组成，由于其特殊的化学组成和两亲型分子结构，抗菌脂肽不仅具有抗菌活性，还具有生物表面活性剂的特性。目前发现的抗菌脂肽主要有表面活性素(surfactin) *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
、芬荠素(fengycin)、伊枯草菌素(iturins)和杆菌霉素(bacillomycin)、抗霉枯草菌素(mycosubtilin)、制磷脂菌素(plipstatin)[1-5]等。己引起广泛的关注。在食品，医疗，工业及环保等领域具有广泛应用。
但就目前国内外研究现状来看，还存在很多制约其工业化生产的瓶颈问题，例如脂肽类抗生素产生菌产抗生素能力普遍较低，且产生的脂肽种类较多，脂肽类抗生素作为一类表面活性剂，在发酵过程中由于气体的通入和搅拌极易产生泡沫导致发酵液的流失等，导致抗菌脂肽的生产成本居高不下，仅限于实验室的应用研究。在抗菌脂肽的发酵过程中使用高效的消泡剂，能够极大的提高营养物质的利用率以及抗菌脂肽的产量，降低生产成本，为抗菌脂肽的广泛应用提供了可能性。魏浩[6]等将大豆油，有机硅消泡剂，聚醚类消泡剂分别用于枯草芽孢杆菌ES-2发酵过程中，研究表明大豆油不仅可以实现有效消泡，还有利于抗菌脂肽发酵，产量高达2497.67mg/L。相较于国外普遍采用的泡沫分离法[7]，使用大豆油作为消泡剂简便有效，易于实现工业化生产，具有良好的应用前景。
但消泡剂的使用给发酵生产带来便利的同时也给下游分离提取带来了困难，若没有较好的除去方法，必将降低产品纯度，甚至影响产物性质，通过抑菌实验发现，使用大豆油作为消泡剂发酵产生的抗菌脂肽失去了抑菌活性，原因是抗菌脂肽与大豆油成分结合形成巨大的胶束。抗菌脂肽抑菌特性的产生是由于其单体能够穿透细菌的细胞膜，导致细菌裂解死亡。形成胶束的抗菌脂肽无法有效的穿透细菌细胞膜，抗菌活性几乎丧失。而传统的酸沉、萃取等方法皆不能将两者有效分离，目前国内有关消泡剂分离的文献报道还很缺乏，因此，为了获得抗菌活性较高的脂肽样品，必须研究出高效可行的方法对抗菌脂肽样品中大豆油成分进行去除。
硅胶柱层析法是一种常用的分离手段，其主要原理是硅胶表面的硅醇基能够与极性物质或非极性物质形成氢键，因此对其具有吸附性，尤其对复杂生物活性物质的分离具有极高的效率。硅胶柱层析法具有分离速度快、效率高、分离效果明显等特点，已被广泛应用与生物活性物质的分离研究[8]，也可应用于工业化生产。因此，本课题首次将硅胶柱层析法应用于消泡剂的去除对抗菌脂肽的工业化应用具有重要的研究意义。
1 材料与方法
1．1 材料与试剂
玻璃层析柱1.1cm×30cm 上海煊盛生化科技有限公司；双槽展开缸20cm×10cm 上海信谊仪器厂； 恒流泵 上海沪西分析仪器厂有限公司；DBS-100电脑全自动部分收集器 上海沪西仪器设备厂；CP-114先行者精密电子天平 美国OHAUS公司；SB5200DT超声波清洗器 宁波新芝生物科技股份有限公司；V-5000分光光度计 上海元析仪器有限公司；Agilent 1100高效液相色谱仪 美国Aglient公司。
淀粉液化芽孢杆菌fmb50为大学酶工程实验室构建与保藏。
消泡剂为金龙鱼精炼一级大豆油；柱层析硅胶(200-300目，工业级) 青岛海洋化工厂；G型薄层层析硅胶板(10cm×20cm) 青岛海洋化工厂；石油醚，乙酸乙酯、氯仿、乙醇、浓氨水(分析纯) 南京试剂厂；乙腈、三氟乙酸(色谱纯) 德国Merk公司。
1．2 方法
1．2．1 抗菌脂肽粗品的制备
将 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
实验室保藏斜面菌种Fmb50于37℃恒温箱中活化10h，挑环接种至BPY培养基，33℃，180rpm条件下振荡培养36h，以5%接种量接种至landy培养基中，于37℃，180rpm条件下振荡培养18h，结束发酵。经预处理即得到抗菌脂肽粗品。
1．2．2 大豆油甘油三酯定量分析方法的建立
大豆油中的主要成分是甘油三酯，其含量达97%，本实验中以甘油三酯作为大豆油定量分析的指标，来确定大豆油的洗脱效果，因而需要对洗脱液中的甘油三酯含量进行测定。薄层色谱-分光光度法[9]因其操作简单、结果可靠，在本实验中被采用。
1．2．2．1 薄层色谱法确定柱层析大豆油洗脱的流动相
薄层色谱法的展开剂可以直接应用于硅胶柱层析。硅胶G板首先在110℃的烘箱中活化30min，设置一系列的石油醚与乙酸乙酯的比例，使用微量进样针吸取5ul的大豆油稀释溶液点于硅胶板上，每个板九个平行。使用不同展开剂展开后，将硅胶板置于碘缸中蒸5min，观察显色情况。计算比迁移率Rf值，取每组的平均值。然后以确定的展开剂对经过预处理后的surfactin样品进行展开，将展开后的硅胶板置于装有浓盐酸的烧杯中，密封后，置于110℃烘箱中，进行原位酸解[10]。酸解后的板以茚三酮溶液染色，与以相同方式展开，与未酸解的硅胶板进行对照，以确定在该流动相下，surfactin是否会被提前洗脱下来。
1．2．2．2 甘油三酯标准曲线的制作
称取40g 200-300目的硅胶，湿法装柱，取1ml大豆油进样，使用1.2.1中确定的流动相以1mL/min的流速进行洗脱，用试管收集器收集流出液，薄层色谱确定流出液中是否只含有甘油三酯。将只含有甘油三酯的流出液合并，吹干溶剂，得到高纯度的甘油三酯样品，经过薄层色谱检测后，可作为甘油三酯标准品使用。配置不同质量浓度的甘油三酯溶液，用微量进样针取5ul标准品点在活化后的硅胶板上，用确定的展开剂展开，待展开剂挥发完全后，以10%的磷钼酸乙醇溶液染色，晾干，置105℃烘箱中显色10min。浓氨水熏蒸除去背景色，抠取显色的斑点于2ml离心管中，加入适量纯净水浸泡，超声35min使硅胶沉淀，取上清液定容至5ml，700nm处测其吸光值，以吸光值为x轴，甘油三酯含量为y轴作图，即得甘油三酯标准曲线。
摘要：本研究建立了硅胶柱层析两步法去除发酵所产抗菌脂肽中的消泡剂成分，采用高效液相色谱（HPLC）检测抗菌脂肽的含量，薄层色谱-可见光分光光度法定量分析消泡剂中甘油三酯含量，TLC法筛选消泡剂的洗脱流动相。结果表明：使用200-300目的硅胶作为柱层析填料，硅胶的总负载量为12.5mg/g时，采用混合流动相（石油醚：乙酸乙酯：乙酸=20:2:1，体积比）以1ml/min流速进行洗脱，可去除高达97.97%的消泡剂成分；采用100% 的乙醇为洗脱流动相，1ml/min流速进行洗脱可将抗菌脂太解析下来，总回收率达到91.52%，纯度从34.07%提高到93.12%。
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关键字:生物表面活性素；消泡剂；硅胶柱层析；分离纯化
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1材料 4
1.2方法 4
1.2.1抗菌脂肽粗品的制备4
1.2.2大豆油甘油三酯定量分析方法的建立4
1.2.3硅胶柱层析5
1.2.4 硅胶柱层析条件优化5
1.2.5回收率和纯度的计算5
1.2.6数据统计方法 5
2结果与分析5
2.1大豆油甘油三酯薄层色谱法展开剂的选择5
2.2大豆油甘油三酯标准曲线的建立6
2.3洗脱大豆油甘油三酯流动相的选择与验证6
2.4柱层析优化7
2.4.1洗脱surfactin流动相的优化7
2.4.2洗脱流速的优化7
2.4.3上样量的优化8
3讨论 8
致谢9
参考文献9
图1甘油三酯浓度与吸光值之间的关系曲线6
图2 流动相对纯度和回收率的影响7
图3流速对回收率和纯度的影响8
图4上样量对回收率和纯度的影响8
表1不同展开剂的薄层层析结果6
表2甘油三酯洗脱实验7
发酵所产抗菌物质中消泡剂的分离
引言
抗菌脂肽一般是由革兰氏阳性芽孢杆菌产生的一类代谢产物，是抗菌肽中的一小类，由亲水的肽链和亲油的脂肪烃链两部分组成，由于其特殊的化学组成和两亲型分子结构，抗菌脂肽不仅具有抗菌活性，还具有生物表面活性剂的特性。目前发现的抗菌脂肽主要有表面活性素(surfactin) *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
、芬荠素(fengycin)、伊枯草菌素(iturins)和杆菌霉素(bacillomycin)、抗霉枯草菌素(mycosubtilin)、制磷脂菌素(plipstatin)[1-5]等。己引起广泛的关注。在食品，医疗，工业及环保等领域具有广泛应用。
但就目前国内外研究现状来看，还存在很多制约其工业化生产的瓶颈问题，例如脂肽类抗生素产生菌产抗生素能力普遍较低，且产生的脂肽种类较多，脂肽类抗生素作为一类表面活性剂，在发酵过程中由于气体的通入和搅拌极易产生泡沫导致发酵液的流失等，导致抗菌脂肽的生产成本居高不下，仅限于实验室的应用研究。在抗菌脂肽的发酵过程中使用高效的消泡剂，能够极大的提高营养物质的利用率以及抗菌脂肽的产量，降低生产成本，为抗菌脂肽的广泛应用提供了可能性。魏浩[6]等将大豆油，有机硅消泡剂，聚醚类消泡剂分别用于枯草芽孢杆菌ES-2发酵过程中，研究表明大豆油不仅可以实现有效消泡，还有利于抗菌脂肽发酵，产量高达2497.67mg/L。相较于国外普遍采用的泡沫分离法[7]，使用大豆油作为消泡剂简便有效，易于实现工业化生产，具有良好的应用前景。
但消泡剂的使用给发酵生产带来便利的同时也给下游分离提取带来了困难，若没有较好的除去方法，必将降低产品纯度，甚至影响产物性质，通过抑菌实验发现，使用大豆油作为消泡剂发酵产生的抗菌脂肽失去了抑菌活性，原因是抗菌脂肽与大豆油成分结合形成巨大的胶束。抗菌脂肽抑菌特性的产生是由于其单体能够穿透细菌的细胞膜，导致细菌裂解死亡。形成胶束的抗菌脂肽无法有效的穿透细菌细胞膜，抗菌活性几乎丧失。而传统的酸沉、萃取等方法皆不能将两者有效分离，目前国内有关消泡剂分离的文献报道还很缺乏，因此，为了获得抗菌活性较高的脂肽样品，必须研究出高效可行的方法对抗菌脂肽样品中大豆油成分进行去除。
硅胶柱层析法是一种常用的分离手段，其主要原理是硅胶表面的硅醇基能够与极性物质或非极性物质形成氢键，因此对其具有吸附性，尤其对复杂生物活性物质的分离具有极高的效率。硅胶柱层析法具有分离速度快、效率高、分离效果明显等特点，已被广泛应用与生物活性物质的分离研究[8]，也可应用于工业化生产。因此，本课题首次将硅胶柱层析法应用于消泡剂的去除对抗菌脂肽的工业化应用具有重要的研究意义。
1 材料与方法
1．1 材料与试剂
玻璃层析柱1.1cm×30cm 上海煊盛生化科技有限公司；双槽展开缸20cm×10cm 上海信谊仪器厂； 恒流泵 上海沪西分析仪器厂有限公司；DBS-100电脑全自动部分收集器 上海沪西仪器设备厂；CP-114先行者精密电子天平 美国OHAUS公司；SB5200DT超声波清洗器 宁波新芝生物科技股份有限公司；V-5000分光光度计 上海元析仪器有限公司；Agilent 1100高效液相色谱仪 美国Aglient公司。
淀粉液化芽孢杆菌fmb50为大学酶工程实验室构建与保藏。
消泡剂为金龙鱼精炼一级大豆油；柱层析硅胶(200-300目，工业级) 青岛海洋化工厂；G型薄层层析硅胶板(10cm×20cm) 青岛海洋化工厂；石油醚，乙酸乙酯、氯仿、乙醇、浓氨水(分析纯) 南京试剂厂；乙腈、三氟乙酸(色谱纯) 德国Merk公司。
1．2 方法
1．2．1 抗菌脂肽粗品的制备
将 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
实验室保藏斜面菌种Fmb50于37℃恒温箱中活化10h，挑环接种至BPY培养基，33℃，180rpm条件下振荡培养36h，以5%接种量接种至landy培养基中，于37℃，180rpm条件下振荡培养18h，结束发酵。经预处理即得到抗菌脂肽粗品。
1．2．2 大豆油甘油三酯定量分析方法的建立
大豆油中的主要成分是甘油三酯，其含量达97%，本实验中以甘油三酯作为大豆油定量分析的指标，来确定大豆油的洗脱效果，因而需要对洗脱液中的甘油三酯含量进行测定。薄层色谱-分光光度法[9]因其操作简单、结果可靠，在本实验中被采用。
1．2．2．1 薄层色谱法确定柱层析大豆油洗脱的流动相
薄层色谱法的展开剂可以直接应用于硅胶柱层析。硅胶G板首先在110℃的烘箱中活化30min，设置一系列的石油醚与乙酸乙酯的比例，使用微量进样针吸取5ul的大豆油稀释溶液点于硅胶板上，每个板九个平行。使用不同展开剂展开后，将硅胶板置于碘缸中蒸5min，观察显色情况。计算比迁移率Rf值，取每组的平均值。然后以确定的展开剂对经过预处理后的surfactin样品进行展开，将展开后的硅胶板置于装有浓盐酸的烧杯中，密封后，置于110℃烘箱中，进行原位酸解[10]。酸解后的板以茚三酮溶液染色，与以相同方式展开，与未酸解的硅胶板进行对照，以确定在该流动相下，surfactin是否会被提前洗脱下来。
1．2．2．2 甘油三酯标准曲线的制作
称取40g 200-300目的硅胶，湿法装柱，取1ml大豆油进样，使用1.2.1中确定的流动相以1mL/min的流速进行洗脱，用试管收集器收集流出液，薄层色谱确定流出液中是否只含有甘油三酯。将只含有甘油三酯的流出液合并，吹干溶剂，得到高纯度的甘油三酯样品，经过薄层色谱检测后，可作为甘油三酯标准品使用。配置不同质量浓度的甘油三酯溶液，用微量进样针取5ul标准品点在活化后的硅胶板上，用确定的展开剂展开，待展开剂挥发完全后，以10%的磷钼酸乙醇溶液染色，晾干，置105℃烘箱中显色10min。浓氨水熏蒸除去背景色，抠取显色的斑点于2ml离心管中，加入适量纯净水浸泡，超声35min使硅胶沉淀，取上清液定容至5ml，700nm处测其吸光值，以吸光值为x轴，甘油三酯含量为y轴作图，即得甘油三酯标准曲线。
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