短小芽孢杆菌静息细胞合成苯基乳酸的工艺研究
短小芽孢杆菌静息细胞合成苯基乳酸的工艺研究[20200408204649]
摘要
3-苯基乳酸（3-Phenyllactic acid, PLA）是一种具有广谱且高效抗菌活力的有机酸。本实验研究利用短小芽孢杆菌静息细胞催化苯丙酮酸合成苯基乳酸的最佳工艺条件。在确定短小芽孢杆菌的最适催化菌龄和转化时间后，利用单因素实验优化影响合成工艺的单因素，分别为：菌体浓度、葡萄糖浓度、底物浓度、转化温度、金属离子种类、pH、吐温。在上述实验的基础上，利用Plackett-Burman法筛选出Ca2+浓度、pH和转化温度为显著因素，最后由Box-Behnken中心组合法设计响应面分析来确定最佳合成工艺参数。结果表明：当[Ca2+]=2 mM、pH= 7.2、温度=40℃时苯基乳酸的产量达到最大值。此条件下，预测值为1.983 g/L，实际值为2.023 g/L 。
*查看完整论文请 +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:苯基乳酸短小芽孢杆菌全细胞转化响应面
目 录
1.引言 1
1.1概述 1
1.2国内外研究状况及现状 1
1.2.1微生物资源的开发 1
1.2.2乳酸菌中PLA的合成途径 1
1.2.3转化PPA生产PLA 2
1.2.4关键酶的识别及其研究 2
1.3项目研究意义 3
1.3.1食品安全离不开食品防腐剂 3
1.3.2苯基乳酸符合未来防腐剂发展的趋势 3
1.3.3苯基乳酸生物合成是今后发展的方向 3
2.材料和方法 5
2.1试验材料 5
2.2仪器与试剂 5
2.3方法 5
2.3.1静息细胞的制备 5
2.3.2静息细胞转化方法 5
2.3.3静息细胞转化条件优化方法 5
2.3.4 HPLC测定苯基乳酸含量 6
3.结果与分析 7
3.1短小芽孢杆菌菌龄对转化的影响 7
3.2转化时间的确定 8
3.3单因素的优化 8
3.4 PB法设计筛选影响细胞转化的显著因素 12
3.5响应面分析设计筛选显著因素的最优水平 14
3.5.1 Box-Behnken实验设计 14
3.5.2最优转化参数预测及实验验证 18
4.结论 21
参考文献 22
致谢 24
1.引言
1.1概述
3-苯基乳酸(3-Phenyllactic acid, PLA)是一种具有广谱且高效的抗菌活力的有机酸，能有效抑制食源性致病细菌、腐败菌[1]，延长食品和饲料保质期，因此作为一种新型的天然防腐剂而被使用和发展。可以由多种微生物(尤其是乳酸菌)代谢苯丙氨酸产生，是赋予乳酸菌发酵产品抗真菌和长货架期的主要活性物质[2]。并且苯基乳酸安全性高，使用安全方便，对于合成许多重要的药物也是非常必要，包括丹参素[3]，能抑制血小板聚集和冠状动脉疾病、血糖过低的蛋白酶抑制剂和抗HIV病毒。故研究优化合成苯基乳酸的工艺条件是必要的。
1.2国内外研究状况及现状
1.2.1微生物资源的开发
苯基乳酸起先是由Lavermicocca等[2]在2000年时分离Lactobacillus plantarum 21B发现的。随后，越来越多具备合成PLA能力的菌种被发现。PLA可能由食源性微生物产生，包括Geotrichum candidum[4]，propioni bacteria[5]和lactic acid bacteria (LAB)[6]。此外，陆续有文献报道其它微生物如Bacillus coagulans[7]和Rubrivivax benzoatilyticus [8]也能够合成PLA。以上研究表明自然界中从厌氧到好氧，从原核到真核微生物中都存在大量的菌系能够自身合成PLA。这些微生物资源的开发有助于发现新基因资源用于生物合成PLA的研究，也为利用这些基因资源进行代谢工程改造奠定了基础。
1.2.2乳酸菌中PLA的合成途径
图1 PLA的合成途径表明苯基乳酸(PLA)实质是由苯丙氨酸(PAA)经过两步反应生成PLA：(1)转氨反应：由芳香族氨基酸转氨酶(ATT)将苯丙氨酸转氨生成苯丙酮酸；(2)还原反应：经脱氢酶(如乳酸脱氢酶)还原生成苯基乳酸。整个过程都是一个可逆反应，所以要想获得高得率的PLA：(1)可添加反应物苯丙氨酸，即采用外源流加方法，且PLA的产量与PAA的添加量呈正相关，但同时随着苯丙氨酸的增加，PLA的产量增加缓慢，且得率在降低，所以要研究最佳的底物浓度；(2)是增强正反应酶的活力，可通过改变反应条件而增强。
图1 PLA合成途径
Fig.1 The Synthetic route of PLA
1.2.3转化PPA生产PLA
转化PAA生产PLA存在成本高、产量低[9]等缺陷，从经济及技术上均存在不可行性及局限性，而从相对廉价的且只需一步还原反应的PPA考虑，则相对简单可行。因此，近些年来研究人员主要围绕利用微生物转化PPA生产PLA进行研究。江南大学Jiang Bo等在研究Lactobacillus sp. SK007时在培养基中以加入PPA的方式增加PLA产量达14倍至1.12g/L[8]。并且结合PPA流加和pH控制策略，PLA产量达到17.3g/L，PPA转化率达到51% 。目前报道的最高PLA产量是由上海交通大学Zheng等分离出一株嗜热菌Bacillus coagulans SDM，在50℃条件下利用静息细胞合成PLA产量达到37.3g/L [7]。以上研究清楚地表明利用微生物营养体细胞或者静息细胞转化PPA生产PLA不仅可行而且具有很大的发展潜力。
1.2.4关键酶的识别及其研究
PPA转化为PLA的反应是一个氧化还原反应。为了识别生产PLA的关键酶，进行酶的活性染色来催化PLA氧化。研究表明[7]没有NAD，PLA就没有氧化活性。
目前的研究大多赞同乳酸脱氢酶(LDH)是PPA生产PLA的关键酶[7,10-11]，如Gummalla S等研究表明在乳酸菌的Phe 分解代谢途径中对PPA 转化为PLA是关键的酶是PLDHase [12]。近年来，Li XF等从Lactobacillus sp. SK2007的产物PLA中提取D-LDH，检测到它对于PPA量有明显的减少作用并且被证实[13]。此项研究还表明，PPA反应的关键酶被确定为L-nLDH和D-nLDH。
1.3项目研究意义
1.3.1食品安全离不开食品防腐剂
现如今，频繁爆出的食品安全问题和严峻的食品安全形势让人深感忧虑，引起了社会的广泛关注。食品安全问题涉及很多环节，任何一个环节出现问题都可能引发严重的食品安全事件，而其中食品的加工和保存无疑是最重要的环节之一。
食品加工及储存过程中的防腐从古至今都是一个不可忽视的问题。高盐、高糖腌制、酸、酒泡制、烟熏等方法一直以来是人们延长食品保质期的主要方法。但随着经济与技术的发展，人们对于食品防腐提出了更高的要求。随后出现的化学合成防腐剂逐渐开始流行，如苯甲酸、山梨酸钾、双乙酸钠、丙酸钙、尼泊金酯等。但同时，化学防腐剂一般为人工合成，相对于天然的食品防腐剂来说，对人体有一定的副作用，并不安全可靠。
但是目前苯基乳酸作为一种天然防腐剂，其价格高昂，因此降低PLA使用成本是促进其广泛应用的前提条件之一。虽然研究报道称苯丙酮酸经Raney-Ni转化可生成PLA，苯丙酮酸转化率和苯基乳酸收率均可达到91%[14]。但是用化学合成法提取PLA：(1)合成过程复杂、条件苛刻，需高温高压；(2)产物为D型和L型消旋混合物，后续分离工作困难；(3)反应过程中使用大量有机溶剂容易产生环境污染。用生物法合成PLA相对于化学法来说，具有反应条件温和、污染小、副产物少、易分离等特点，它是将微生物整体细胞（静息细胞）作为反应催化剂，对外缘底物进行结构修饰的一种微生物转化方法[15]。
1.3.2苯基乳酸符合未来防腐剂发展的趋势
3-苯基乳酸(PLA)是一种广泛存在于乳酸菌发酵产品和蜂蜜中的有机酸，并被建议作为一种蜂蜜产品的化学标记物[16]。该有机酸是由多种微生物(尤其是乳酸菌)代谢苯丙氨酸产生的代谢产物，是赋予乳酸菌发酵产品抗真菌和长货架期的主要活性物质[6]。PLA作为一种新型天然来源的抑菌物质受到了广泛关注。众多研究已经证实PLA具有广谱且高效的抗菌活力，并且可以替代抗生素用于家畜饲养[1]。这种由公认为安全的乳酸菌代谢产生的芳香族有机酸经研究表明其对人和动物细胞均无毒性[17]。另外，与多数天然防腐剂相比，PLA具有更广的抑菌谱，特别是能够抑制真菌污染，而且其水溶性和热稳定性好，作用pH范围宽，这些优点利于其在食品工业的广泛应用[17,18]。
摘要
3-苯基乳酸（3-Phenyllactic acid, PLA）是一种具有广谱且高效抗菌活力的有机酸。本实验研究利用短小芽孢杆菌静息细胞催化苯丙酮酸合成苯基乳酸的最佳工艺条件。在确定短小芽孢杆菌的最适催化菌龄和转化时间后，利用单因素实验优化影响合成工艺的单因素，分别为：菌体浓度、葡萄糖浓度、底物浓度、转化温度、金属离子种类、pH、吐温。在上述实验的基础上，利用Plackett-Burman法筛选出Ca2+浓度、pH和转化温度为显著因素，最后由Box-Behnken中心组合法设计响应面分析来确定最佳合成工艺参数。结果表明：当[Ca2+]=2 mM、pH= 7.2、温度=40℃时苯基乳酸的产量达到最大值。此条件下，预测值为1.983 g/L，实际值为2.023 g/L 。
*查看完整论文请 +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:苯基乳酸短小芽孢杆菌全细胞转化响应面
目 录
1.引言 1
1.1概述 1
1.2国内外研究状况及现状 1
1.2.1微生物资源的开发 1
1.2.2乳酸菌中PLA的合成途径 1
1.2.3转化PPA生产PLA 2
1.2.4关键酶的识别及其研究 2
1.3项目研究意义 3
1.3.1食品安全离不开食品防腐剂 3
1.3.2苯基乳酸符合未来防腐剂发展的趋势 3
1.3.3苯基乳酸生物合成是今后发展的方向 3
2.材料和方法 5
2.1试验材料 5
2.2仪器与试剂 5
2.3方法 5
2.3.1静息细胞的制备 5
2.3.2静息细胞转化方法 5
2.3.3静息细胞转化条件优化方法 5
2.3.4 HPLC测定苯基乳酸含量 6
3.结果与分析 7
3.1短小芽孢杆菌菌龄对转化的影响 7
3.2转化时间的确定 8
3.3单因素的优化 8
3.4 PB法设计筛选影响细胞转化的显著因素 12
3.5响应面分析设计筛选显著因素的最优水平 14
3.5.1 Box-Behnken实验设计 14
3.5.2最优转化参数预测及实验验证 18
4.结论 21
参考文献 22
致谢 24
1.引言
1.1概述
3-苯基乳酸(3-Phenyllactic acid, PLA)是一种具有广谱且高效的抗菌活力的有机酸，能有效抑制食源性致病细菌、腐败菌[1]，延长食品和饲料保质期，因此作为一种新型的天然防腐剂而被使用和发展。可以由多种微生物(尤其是乳酸菌)代谢苯丙氨酸产生，是赋予乳酸菌发酵产品抗真菌和长货架期的主要活性物质[2]。并且苯基乳酸安全性高，使用安全方便，对于合成许多重要的药物也是非常必要，包括丹参素[3]，能抑制血小板聚集和冠状动脉疾病、血糖过低的蛋白酶抑制剂和抗HIV病毒。故研究优化合成苯基乳酸的工艺条件是必要的。
1.2国内外研究状况及现状
1.2.1微生物资源的开发
苯基乳酸起先是由Lavermicocca等[2]在2000年时分离Lactobacillus plantarum 21B发现的。随后，越来越多具备合成PLA能力的菌种被发现。PLA可能由食源性微生物产生，包括Geotrichum candidum[4]，propioni bacteria[5]和lactic acid bacteria (LAB)[6]。此外，陆续有文献报道其它微生物如Bacillus coagulans[7]和Rubrivivax benzoatilyticus [8]也能够合成PLA。以上研究表明自然界中从厌氧到好氧，从原核到真核微生物中都存在大量的菌系能够自身合成PLA。这些微生物资源的开发有助于发现新基因资源用于生物合成PLA的研究，也为利用这些基因资源进行代谢工程改造奠定了基础。
1.2.2乳酸菌中PLA的合成途径
图1 PLA的合成途径表明苯基乳酸(PLA)实质是由苯丙氨酸(PAA)经过两步反应生成PLA：(1)转氨反应：由芳香族氨基酸转氨酶(ATT)将苯丙氨酸转氨生成苯丙酮酸；(2)还原反应：经脱氢酶(如乳酸脱氢酶)还原生成苯基乳酸。整个过程都是一个可逆反应，所以要想获得高得率的PLA：(1)可添加反应物苯丙氨酸，即采用外源流加方法，且PLA的产量与PAA的添加量呈正相关，但同时随着苯丙氨酸的增加，PLA的产量增加缓慢，且得率在降低，所以要研究最佳的底物浓度；(2)是增强正反应酶的活力，可通过改变反应条件而增强。
图1 PLA合成途径
Fig.1 The Synthetic route of PLA
1.2.3转化PPA生产PLA
转化PAA生产PLA存在成本高、产量低[9]等缺陷，从经济及技术上均存在不可行性及局限性，而从相对廉价的且只需一步还原反应的PPA考虑，则相对简单可行。因此，近些年来研究人员主要围绕利用微生物转化PPA生产PLA进行研究。江南大学Jiang Bo等在研究Lactobacillus sp. SK007时在培养基中以加入PPA的方式增加PLA产量达14倍至1.12g/L[8]。并且结合PPA流加和pH控制策略，PLA产量达到17.3g/L，PPA转化率达到51% 。目前报道的最高PLA产量是由上海交通大学Zheng等分离出一株嗜热菌Bacillus coagulans SDM，在50℃条件下利用静息细胞合成PLA产量达到37.3g/L [7]。以上研究清楚地表明利用微生物营养体细胞或者静息细胞转化PPA生产PLA不仅可行而且具有很大的发展潜力。
1.2.4关键酶的识别及其研究
PPA转化为PLA的反应是一个氧化还原反应。为了识别生产PLA的关键酶，进行酶的活性染色来催化PLA氧化。研究表明[7]没有NAD，PLA就没有氧化活性。
目前的研究大多赞同乳酸脱氢酶(LDH)是PPA生产PLA的关键酶[7,10-11]，如Gummalla S等研究表明在乳酸菌的Phe 分解代谢途径中对PPA 转化为PLA是关键的酶是PLDHase [12]。近年来，Li XF等从Lactobacillus sp. SK2007的产物PLA中提取D-LDH，检测到它对于PPA量有明显的减少作用并且被证实[13]。此项研究还表明，PPA反应的关键酶被确定为L-nLDH和D-nLDH。
1.3项目研究意义
1.3.1食品安全离不开食品防腐剂
现如今，频繁爆出的食品安全问题和严峻的食品安全形势让人深感忧虑，引起了社会的广泛关注。食品安全问题涉及很多环节，任何一个环节出现问题都可能引发严重的食品安全事件，而其中食品的加工和保存无疑是最重要的环节之一。
食品加工及储存过程中的防腐从古至今都是一个不可忽视的问题。高盐、高糖腌制、酸、酒泡制、烟熏等方法一直以来是人们延长食品保质期的主要方法。但随着经济与技术的发展，人们对于食品防腐提出了更高的要求。随后出现的化学合成防腐剂逐渐开始流行，如苯甲酸、山梨酸钾、双乙酸钠、丙酸钙、尼泊金酯等。但同时，化学防腐剂一般为人工合成，相对于天然的食品防腐剂来说，对人体有一定的副作用，并不安全可靠。
但是目前苯基乳酸作为一种天然防腐剂，其价格高昂，因此降低PLA使用成本是促进其广泛应用的前提条件之一。虽然研究报道称苯丙酮酸经Raney-Ni转化可生成PLA，苯丙酮酸转化率和苯基乳酸收率均可达到91%[14]。但是用化学合成法提取PLA：(1)合成过程复杂、条件苛刻，需高温高压；(2)产物为D型和L型消旋混合物，后续分离工作困难；(3)反应过程中使用大量有机溶剂容易产生环境污染。用生物法合成PLA相对于化学法来说，具有反应条件温和、污染小、副产物少、易分离等特点，它是将微生物整体细胞（静息细胞）作为反应催化剂，对外缘底物进行结构修饰的一种微生物转化方法[15]。
1.3.2苯基乳酸符合未来防腐剂发展的趋势
3-苯基乳酸(PLA)是一种广泛存在于乳酸菌发酵产品和蜂蜜中的有机酸，并被建议作为一种蜂蜜产品的化学标记物[16]。该有机酸是由多种微生物(尤其是乳酸菌)代谢苯丙氨酸产生的代谢产物，是赋予乳酸菌发酵产品抗真菌和长货架期的主要活性物质[6]。PLA作为一种新型天然来源的抑菌物质受到了广泛关注。众多研究已经证实PLA具有广谱且高效的抗菌活力，并且可以替代抗生素用于家畜饲养[1]。这种由公认为安全的乳酸菌代谢产生的芳香族有机酸经研究表明其对人和动物细胞均无毒性[17]。另外，与多数天然防腐剂相比，PLA具有更广的抑菌谱，特别是能够抑制真菌污染，而且其水溶性和热稳定性好，作用pH范围宽，这些优点利于其在食品工业的广泛应用[17,18]。
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