制铁棒锤中3种单酯生物碱成分的含量测定研究(附件)
摘 要本文参照2015版中国药典中制川乌的提取方法和的测定手段，对甘肃产铁棒锤炮制品中3种单酯型生物碱含量进行测定研究，研究探讨制铁棒锤中单酯生物碱的含量测定方法，为制铁棒槌的合理使用和安全控制提供借鉴和参考依据。色谱柱：Diamonsil C18柱（250mm×4.6mm,5μm）；流动相：A：乙腈－四氢呋喃（25:15），B：0.1mol/L 醋酸铵溶液（每1000 mL加冰乙酸0.5 mL）；流速：1.0ml/min；梯度洗脱：检测波长为235nm。在上述色谱条件下3种指标性成分可完全分离，其线性范围分别为：苯甲酰乌头原碱0.3626～1.813μg（R2=0.9989）、苯甲酰次乌头原碱0.4312～2.1560μg（R2=0.9945）、苯甲酰新乌头原碱0.4900～2.4500μg（R2=0.9955），回收率分别为：96.73%，RSD=1.06%；96.21%，RSD=1.36%；95.82%，RSD=1.12%。此方法简单准确度高，可用于制铁棒锤中3种单酯生物碱的含量测定研究。甘肃产制铁棒锤中3种单酯生物碱的总量为0.119%，制川乌中3种单酯生物碱的控制范围是0.070%-0.150%，制铁棒锤资源优质，在临床使用时注意用量。 目 录
1 绪论
1.1 铁棒锤炮制方法概述 1
1.2 铁棒锤的药理作用 2
1.2.1铁棒锤毒性研究 2
1.2.2镇痛作用 2
1.2.3抗炎作用 3
1.2.4抗肿瘤作用 3
1.3 铁棒锤临床应用 4
2 实验研究
2.1 实验仪器及材料 5
2.1.1实验仪器 5
2.1.2实验试药 5
2.2 方法及结果 5
2.2.1色谱条件 5
2.2.2制铁棒锤对照品溶液的制备 6
2.2.3制铁棒锤供试品溶液的制备 6
2.2.4制铁棒锤线性关系考察 6
2.2.5制铁棒锤精密度试验 9
2.2.6制铁棒锤重复性试验 10
2.2.7制铁棒锤稳定性试验 11
2.2.8制铁棒锤加样回收率试验 13
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
/> 2.2.1色谱条件 5
2.2.2制铁棒锤对照品溶液的制备 6
2.2.3制铁棒锤供试品溶液的制备 6
2.2.4制铁棒锤线性关系考察 6
2.2.5制铁棒锤精密度试验 9
2.2.6制铁棒锤重复性试验 10
2.2.7制铁棒锤稳定性试验 11
2.2.8制铁棒锤加样回收率试验 13
2.2.9制铁棒锤样品含量测定 14
2.3 讨论 16
结 论 18
参考文献 19
致 谢 21
1 绪论
铁棒锤为毛茛科植物铁棒锤（Aconitunszechenyianum Gay）和伏毛铁棒锤（Aconitum flavum Hand.Mazz）的干燥块根，生长于2000～3700m的山顶草地或林下，7～8月间采集，除去茎苗，洗净晒干[1]，主产于四川、云南、甘肃南部、青海等地。别名为铁牛七、一支箭、三转半、雪上一支蒿[1～2]。铁棒锤与川乌同属乌头属类药材，因此铁棒锤中有效成分与川乌中有效成分相似，在文献中记载本品具有性味有辛、苦、热的特性，具有“活血祛瘀、祛风除湿、消肿止痛”的功效，可用于跌打损伤、风湿痹痛[1]。
铁棒锤植物来源有铁棒锤和伏毛铁棒锤两种，但其形状特征有明显的差别:铁棒锤个子药材多粗壮，圆柱形，长5～6㎝，多饱满，表面灰棕色，稍粗糙，具有纵皱纹，质硬，不易折断，断面平坦，断面灰白色。而伏毛铁棒锤个子药材呈长纺锤形、长圆锥形、棒形或圆柱形，可长达12㎝，有时弯曲，表明深灰黄褐色、深黄褐色至深棕色，具细纵皱纹或略粗的皱缩，质硬脆，断面淡黄棕色或黄白色，粉性或呈角质样，气微，味麻舌[3]。因铁棒锤中有大毒，为使用药安全一般需炮制后使用，铁棒锤使用时多外用，研末调敷，或煎水洗，而铁棒锤炮制品内服时，煎汤剂用量一般为1.5～3g，研末服用时用量一般为0.06～0.15 g。对于本品，孕妇忌用，服用本品后忌热饮食、烟、酒两小时。
1.1 铁棒锤炮制方法概述
铁棒锤具有大毒，其化学成分为生物碱类，它具有治疗作用和使人中毒的两面性，因此一般须炮制后使用，使其毒性大大降低。在铁棒锤经过加工变为制铁棒锤的过程中，铁棒锤中生物中酯基断裂转化为制铁棒锤中的单酯型，即可以大大的降低在使用铁棒锤时毒副作用又可保证其药物疗效。
铁棒锤作为民族药材，各民族的医生对于铁棒锤的炮制工艺也不尽相同。回医对于铁棒锤的炮制方法是煨制。羌医对于铁棒锤药材的炮制方法为童便制。因铁棒锤药材主产地之一是青海、西藏，所以藏医对于铁棒锤的炮制方法研究较多，主要有柯子制；煮制；青稞酒制；炒制；热制；青稞酒炒制。对于四川和陕西产地铁棒锤的炮制工艺也有所不同，四川用铁棒锤炮制品，炮制时应用水浸泡7天，每日换水2次，软透饮片，蒸2～3小时，晒干，再用猪油拌炒，可使毒性大减[4]。对于陕西产铁棒锤药材，炮制时取净制铁棒锤与5%的甘草水泡漂，夏季1天，春、秋2天，冬季3天，每日换水2次，至铁棒锤药材内无干心时，取出，再同5%的黑豆煮2小时，口尝微有麻舌感时，取出晾至6成干，晒干[5]。
各民族对于铁棒锤的减毒方法各有不同，但通过对铁棒锤炮制方法的概述可知，铁棒锤的减毒机理主要为酯键水解和高温热解。有文献研究表明将乌头碱、新乌头碱和次乌头碱3种双酯型生物碱在高温下水解,再结合柱层析方法制备得到苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱3种单酯型生物碱,通过HPLC、MS、1HNMR、13CNMR等方法进行纯度、结构鉴定.结果 制备得到的苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱质量分数分别为98.6％、98.5％、99.3％[6]。
对于铁棒锤的最佳炮制工艺，有相关文献研究表明回药伏毛铁棒锤的最佳烘制工艺为：饮片厚度1～2㎜时于105℃烘制3h[7]。铁棒锤的不同炮制工艺都对其毒性有所减少，但是在建立安全性评价体系时不单单以一种或几种指标成分为代表，还要检测它的重金属含量、总灰分等，对于铁棒锤炮制品中重金属的含量，张帆等[8]研究文献表明藏医和羌医的炮制方法将导致重金属Hg的含量急剧增加，临床使用铁棒锤时存在安全隐患，所以铁棒锤的最佳炮制工艺有待研究。
1.2 铁棒锤的药理作用
1.2.1 铁棒锤毒性研究
铁棒锤具有大毒，主要为生物碱类，其化学成分具有治疗作用和使人中毒的两面性。铁棒锤的主要化学成分有：雪乌头碱（penduline）、次乌头碱(hypaconitine)、乌头碱(aconitine)、3乙酰乌头碱（3acetylaconitine）[9] 。药理学中指出，口服纯乌头碱0.2㎎即可中毒，3～5㎎可致死，极容易中毒。同时配伍不当也有可能增加乌头碱的中毒机率，如乌头与半夏两种中药相配伍，可以引起中毒。对于铁棒锤药材炮制的工艺没有达到指定的操作范围，是因为铁棒锤中乌头碱类成分还没有完全的分解，口尝还是有稍微麻舌感都有可能中毒。对于铁棒锤中毒，一般我们用它的拮抗剂阿托品进行抢救。
1.2.2 镇痛作用
铁棒锤药材中乌头碱、3乙酰乌头碱、去氧乌头碱等成分对于疼痛的治疗具有显著的疗效。小鼠皮下注射乌头碱的最小镇痛剂量为25μg/kg，镇痛指数为11.8，东莨菪碱可加强其作用[10]。次乌头碱和乌头原碱用热板法测定法对小鼠有镇痛和镇静作用。在70年代期间经甘肃兰州部队第六医院临床验证近15000病例，并经中科院上海药物研究确定其有效成分为3乙酰
1 绪论
1.1 铁棒锤炮制方法概述 1
1.2 铁棒锤的药理作用 2
1.2.1铁棒锤毒性研究 2
1.2.2镇痛作用 2
1.2.3抗炎作用 3
1.2.4抗肿瘤作用 3
1.3 铁棒锤临床应用 4
2 实验研究
2.1 实验仪器及材料 5
2.1.1实验仪器 5
2.1.2实验试药 5
2.2 方法及结果 5
2.2.1色谱条件 5
2.2.2制铁棒锤对照品溶液的制备 6
2.2.3制铁棒锤供试品溶液的制备 6
2.2.4制铁棒锤线性关系考察 6
2.2.5制铁棒锤精密度试验 9
2.2.6制铁棒锤重复性试验 10
2.2.7制铁棒锤稳定性试验 11
2.2.8制铁棒锤加样回收率试验 13
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
/> 2.2.1色谱条件 5
2.2.2制铁棒锤对照品溶液的制备 6
2.2.3制铁棒锤供试品溶液的制备 6
2.2.4制铁棒锤线性关系考察 6
2.2.5制铁棒锤精密度试验 9
2.2.6制铁棒锤重复性试验 10
2.2.7制铁棒锤稳定性试验 11
2.2.8制铁棒锤加样回收率试验 13
2.2.9制铁棒锤样品含量测定 14
2.3 讨论 16
结 论 18
参考文献 19
致 谢 21
1 绪论
铁棒锤为毛茛科植物铁棒锤（Aconitunszechenyianum Gay）和伏毛铁棒锤（Aconitum flavum Hand.Mazz）的干燥块根，生长于2000～3700m的山顶草地或林下，7～8月间采集，除去茎苗，洗净晒干[1]，主产于四川、云南、甘肃南部、青海等地。别名为铁牛七、一支箭、三转半、雪上一支蒿[1～2]。铁棒锤与川乌同属乌头属类药材，因此铁棒锤中有效成分与川乌中有效成分相似，在文献中记载本品具有性味有辛、苦、热的特性，具有“活血祛瘀、祛风除湿、消肿止痛”的功效，可用于跌打损伤、风湿痹痛[1]。
铁棒锤植物来源有铁棒锤和伏毛铁棒锤两种，但其形状特征有明显的差别:铁棒锤个子药材多粗壮，圆柱形，长5～6㎝，多饱满，表面灰棕色，稍粗糙，具有纵皱纹，质硬，不易折断，断面平坦，断面灰白色。而伏毛铁棒锤个子药材呈长纺锤形、长圆锥形、棒形或圆柱形，可长达12㎝，有时弯曲，表明深灰黄褐色、深黄褐色至深棕色，具细纵皱纹或略粗的皱缩，质硬脆，断面淡黄棕色或黄白色，粉性或呈角质样，气微，味麻舌[3]。因铁棒锤中有大毒，为使用药安全一般需炮制后使用，铁棒锤使用时多外用，研末调敷，或煎水洗，而铁棒锤炮制品内服时，煎汤剂用量一般为1.5～3g，研末服用时用量一般为0.06～0.15 g。对于本品，孕妇忌用，服用本品后忌热饮食、烟、酒两小时。
1.1 铁棒锤炮制方法概述
铁棒锤具有大毒，其化学成分为生物碱类，它具有治疗作用和使人中毒的两面性，因此一般须炮制后使用，使其毒性大大降低。在铁棒锤经过加工变为制铁棒锤的过程中，铁棒锤中生物中酯基断裂转化为制铁棒锤中的单酯型，即可以大大的降低在使用铁棒锤时毒副作用又可保证其药物疗效。
铁棒锤作为民族药材，各民族的医生对于铁棒锤的炮制工艺也不尽相同。回医对于铁棒锤的炮制方法是煨制。羌医对于铁棒锤药材的炮制方法为童便制。因铁棒锤药材主产地之一是青海、西藏，所以藏医对于铁棒锤的炮制方法研究较多，主要有柯子制；煮制；青稞酒制；炒制；热制；青稞酒炒制。对于四川和陕西产地铁棒锤的炮制工艺也有所不同，四川用铁棒锤炮制品，炮制时应用水浸泡7天，每日换水2次，软透饮片，蒸2～3小时，晒干，再用猪油拌炒，可使毒性大减[4]。对于陕西产铁棒锤药材，炮制时取净制铁棒锤与5%的甘草水泡漂，夏季1天，春、秋2天，冬季3天，每日换水2次，至铁棒锤药材内无干心时，取出，再同5%的黑豆煮2小时，口尝微有麻舌感时，取出晾至6成干，晒干[5]。
各民族对于铁棒锤的减毒方法各有不同，但通过对铁棒锤炮制方法的概述可知，铁棒锤的减毒机理主要为酯键水解和高温热解。有文献研究表明将乌头碱、新乌头碱和次乌头碱3种双酯型生物碱在高温下水解,再结合柱层析方法制备得到苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱3种单酯型生物碱,通过HPLC、MS、1HNMR、13CNMR等方法进行纯度、结构鉴定.结果 制备得到的苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱质量分数分别为98.6％、98.5％、99.3％[6]。
对于铁棒锤的最佳炮制工艺，有相关文献研究表明回药伏毛铁棒锤的最佳烘制工艺为：饮片厚度1～2㎜时于105℃烘制3h[7]。铁棒锤的不同炮制工艺都对其毒性有所减少，但是在建立安全性评价体系时不单单以一种或几种指标成分为代表，还要检测它的重金属含量、总灰分等，对于铁棒锤炮制品中重金属的含量，张帆等[8]研究文献表明藏医和羌医的炮制方法将导致重金属Hg的含量急剧增加，临床使用铁棒锤时存在安全隐患，所以铁棒锤的最佳炮制工艺有待研究。
1.2 铁棒锤的药理作用
1.2.1 铁棒锤毒性研究
铁棒锤具有大毒，主要为生物碱类，其化学成分具有治疗作用和使人中毒的两面性。铁棒锤的主要化学成分有：雪乌头碱（penduline）、次乌头碱(hypaconitine)、乌头碱(aconitine)、3乙酰乌头碱（3acetylaconitine）[9] 。药理学中指出，口服纯乌头碱0.2㎎即可中毒，3～5㎎可致死，极容易中毒。同时配伍不当也有可能增加乌头碱的中毒机率，如乌头与半夏两种中药相配伍，可以引起中毒。对于铁棒锤药材炮制的工艺没有达到指定的操作范围，是因为铁棒锤中乌头碱类成分还没有完全的分解，口尝还是有稍微麻舌感都有可能中毒。对于铁棒锤中毒，一般我们用它的拮抗剂阿托品进行抢救。
1.2.2 镇痛作用
铁棒锤药材中乌头碱、3乙酰乌头碱、去氧乌头碱等成分对于疼痛的治疗具有显著的疗效。小鼠皮下注射乌头碱的最小镇痛剂量为25μg/kg，镇痛指数为11.8，东莨菪碱可加强其作用[10]。次乌头碱和乌头原碱用热板法测定法对小鼠有镇痛和镇静作用。在70年代期间经甘肃兰州部队第六医院临床验证近15000病例，并经中科院上海药物研究确定其有效成分为3乙酰
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