鸡肌肉组织n糖组的分离提取方法研究
摘要：本研究旨在对比鸡肌肉组织中糖蛋白的提取方法，并利用PNGase F和超高压液相色谱法分离出糖蛋白中的N-糖链。研究中使用了鸡肉、鸡肝、鸡肾三种组织作为样品，比较了两种提取方法。一种方法是采用胃蛋白酶消化样品并经阳离子交换柱富集糖肽得到糖蛋白；另一种方法是采用三氯乙酸处理样品，使其蛋白质沉淀而得到糖蛋白。两种方法得到的糖蛋白均采用PNGase F释放其中的N-糖链，并结合超高压液相色谱法分离N-糖链。对这两种方法下获得的图谱进行对比和分析后，发现后一种方法具有样品损失少的优点。该方法及所获得图谱有助于对N-糖链做进一步的结构分析和功能研究。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言 1
1 材料与方法2
材料与仪器 2
试验PNGaes F的活性 3
1.2.1 材料的选取 3
1.2.2糖链的释放3
1.2.3糖链的纯化3
1.2.4 糖链的荧光衍生3
1.2.5 超高压液相色谱条件3
1.3 胃蛋白酶—阳离子交换柱—G25柱处理法（A组） 3
1.3.1 材料前处理3
1.3.2 胃蛋白酶的消化和糖肽的富集3
1.3.3 糖链的释放4
1.3.4糖链的纯化4
1.3.5 糖链的荧光衍生4
1.3.6 超高压液相色谱条件4
1.4 TCA处理法（B组和C组） 4
1.4.1 材料前处理4
1.4.2 三氯乙酸沉淀蛋白质 4
1.4.3去除游离糖4
1.4.4 糖链的释放5
1.4.5 糖链的纯化5
1.4.6 糖链的荧光衍生5
2 结果与分析 5
2.1 PNGase F活性试验结果 5
2.2 A、B、C三组方法对比 6
2.3 鸡源组织中N糖链提取的结果6
2.3.1 胃蛋白酶—阳离子交换柱—G25法处理后的结果（A组）7
2.3.2 TCA
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
法处理样品后的结果（B组和C组）8
2.4 A、B、C三组结果的对比及分析10
3 总结 13
致谢14
参考文献14
图1 胎球蛋白（Fetuin）N糖链的提取结果6
图2 乳铁蛋白（Lactoferrin）N糖链的提取结果6
图3 鸡肝组织N糖链（A组）的提取结果7
图4 鸡肉组织N糖链（A组）的提取结果7
图5 鸡肾组织N糖链（A组）的提取结果8
图6 鸡肝组织N糖链（B组）的提取结果8
图7 鸡肉组织N糖链（B组）的提取结果9
图8 鸡肾组织N糖链（B组）的提取结果9
图9 鸡肝组织N糖链（C组）的提取结果9
图10 鸡肉组织N糖链（C组）的提取结果10
图11 鸡肾组织N糖链（C组）的提取结果10
图12 鸡肝A、B、C三组结果对比 11
图13 鸡肉A、B、C三组结果对比 12
图14 鸡肾A、B、C三组结果对比 13
表1 液相色谱洗脱程序3
表2 液相色谱洗脱程序4
表3 液相色谱洗脱程序5
表4 A、B、C三组方法对比6
鸡肌肉组织N糖组的分离提取方法研究
引言
自从1988年牛津大学Dwek教授首次提出糖生物学的概念以来，糖生物学在糖链结构、生物合成、生理功能等方面取得了极大的进展。作为第三种生命信息分子的糖链正日益受到重视，糖组学也应运而生。糖组是指细胞内所有的糖链（包括糖复合物），类似基因组学和蛋白质组学。糖组学则是研究糖链的表达、调控和生理功能的科学(((。近20多年来研究发现，糖链参与了各种生命现象的调节, 如细胞识别、粘连与融合、信号传导、免疫与应答、细胞转化、分化与反分化等等，例如有8种人类遗传疾病是由N糖链的合成缺陷造成的(2(。由于糖链所具有的重要的生理功能，使得人们对糖链和疾病之间的关系展开了广泛的研究。而对糖链在食品中的应用则研究得比较少。事实上，对糖链的研究将有助于新的功能性食品和新的食品添加剂的研发。因此，糖链的分离提取在食品工业中具有很重要的意义。
糖链又分为糖蛋白糖链、糖脂糖链、蛋白聚糖糖链等(3(。而糖蛋白糖链中根据糖链与蛋白质的连接方式不同，主要分为N糖链和O糖链。为了更好的分析和研究糖链，需要把糖链从糖蛋白上释放下来。因此，糖链的提取一直是糖组学研究关键所在。特别是如何从动物膳食肌肉组织中提取糖链，目前的研究并不广泛。而且糖链具有微观不均一性，所以很难分离得到结构完全相同的生物糖链(4(。由于其结构的复杂多样，分析方法有限，研究远滞后于蛋白链与核酸链(5(。本课题旨在研究如何从动物膳食肌肉组织中分离提取N糖链。
首先以鸡肌肉组织为研究对象，取鸡肉、鸡肝和鸡肾作为样品，提取糖蛋白。提取过程中使用了两种方法，一种是将样品用胃蛋白酶消化，之后过阳离子交换柱富集糖肽，再经过G25柱除盐的方法，另一种是向样品中直接加入三氯乙酸（TCA），使其蛋白质沉淀的方法。
然后，将两种方法提取的糖蛋白均采用酶法释放糖链。根据N糖链和O糖链糖肽键的不同，可采取不同的方法来释放糖链。N糖链是其糖蛋白中寡糖链的N乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）与蛋白质中的天冬酰胺的酰胺基相连，其分布相当广泛(6(。目前，N糖链的释放方法主要包括酶解法和化学释放法。化学释放法通常是在碱性条件下进行，会出现一些副反应，比如降解现象、去乙酰基和脱唾液酸等，使结果分析不完整(7((8(。因此，酶法是目前释放N糖链的常用方法。本实验采用 PNGase F 酶解释放 N糖链，它能酶解糖蛋白上天冬酰胺与乙酰葡萄糖胺基团之间的连接，该酶催化活性极高，适用于包括多种类型的N糖链如高甘露糖型、杂合型和复杂型糖链(9(。PNGase F 酶能释放除了核心N乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）被α 3岩藻糖基化的以外的所有类型的N糖链，是酶解N糖链最常用的酶((((。由于本实验使用的PNGase F酶为实验室自制的，所以要在使用之前先试验其活性。
最后，将经过碳柱纯化和2氨基苯甲酰胺（2AB）标记的样品用超高压液相色谱（UHPLC）法分离N糖链。通常，高效液相色谱（HPLC）是目前广泛使用的技术，它可以对糖链结构进行分离和鉴定。而与常规的HPLC法相比，本实验中所使用的UHPLC法具有更快的分析速度、更好的分离度和更高的灵敏度。
将得到图谱进行对比后得出结论，通过TCA法处理得到的糖蛋白具有含量损失少的优点，有利于后期对糖链做进一步的结构分析和功能研究。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言 1
1 材料与方法2
材料与仪器 2
试验PNGaes F的活性 3
1.2.1 材料的选取 3
1.2.2糖链的释放3
1.2.3糖链的纯化3
1.2.4 糖链的荧光衍生3
1.2.5 超高压液相色谱条件3
1.3 胃蛋白酶—阳离子交换柱—G25柱处理法（A组） 3
1.3.1 材料前处理3
1.3.2 胃蛋白酶的消化和糖肽的富集3
1.3.3 糖链的释放4
1.3.4糖链的纯化4
1.3.5 糖链的荧光衍生4
1.3.6 超高压液相色谱条件4
1.4 TCA处理法（B组和C组） 4
1.4.1 材料前处理4
1.4.2 三氯乙酸沉淀蛋白质 4
1.4.3去除游离糖4
1.4.4 糖链的释放5
1.4.5 糖链的纯化5
1.4.6 糖链的荧光衍生5
2 结果与分析 5
2.1 PNGase F活性试验结果 5
2.2 A、B、C三组方法对比 6
2.3 鸡源组织中N糖链提取的结果6
2.3.1 胃蛋白酶—阳离子交换柱—G25法处理后的结果（A组）7
2.3.2 TCA
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
法处理样品后的结果（B组和C组）8
2.4 A、B、C三组结果的对比及分析10
3 总结 13
致谢14
参考文献14
图1 胎球蛋白（Fetuin）N糖链的提取结果6
图2 乳铁蛋白（Lactoferrin）N糖链的提取结果6
图3 鸡肝组织N糖链（A组）的提取结果7
图4 鸡肉组织N糖链（A组）的提取结果7
图5 鸡肾组织N糖链（A组）的提取结果8
图6 鸡肝组织N糖链（B组）的提取结果8
图7 鸡肉组织N糖链（B组）的提取结果9
图8 鸡肾组织N糖链（B组）的提取结果9
图9 鸡肝组织N糖链（C组）的提取结果9
图10 鸡肉组织N糖链（C组）的提取结果10
图11 鸡肾组织N糖链（C组）的提取结果10
图12 鸡肝A、B、C三组结果对比 11
图13 鸡肉A、B、C三组结果对比 12
图14 鸡肾A、B、C三组结果对比 13
表1 液相色谱洗脱程序3
表2 液相色谱洗脱程序4
表3 液相色谱洗脱程序5
表4 A、B、C三组方法对比6
鸡肌肉组织N糖组的分离提取方法研究
引言
自从1988年牛津大学Dwek教授首次提出糖生物学的概念以来，糖生物学在糖链结构、生物合成、生理功能等方面取得了极大的进展。作为第三种生命信息分子的糖链正日益受到重视，糖组学也应运而生。糖组是指细胞内所有的糖链（包括糖复合物），类似基因组学和蛋白质组学。糖组学则是研究糖链的表达、调控和生理功能的科学(((。近20多年来研究发现，糖链参与了各种生命现象的调节, 如细胞识别、粘连与融合、信号传导、免疫与应答、细胞转化、分化与反分化等等，例如有8种人类遗传疾病是由N糖链的合成缺陷造成的(2(。由于糖链所具有的重要的生理功能，使得人们对糖链和疾病之间的关系展开了广泛的研究。而对糖链在食品中的应用则研究得比较少。事实上，对糖链的研究将有助于新的功能性食品和新的食品添加剂的研发。因此，糖链的分离提取在食品工业中具有很重要的意义。
糖链又分为糖蛋白糖链、糖脂糖链、蛋白聚糖糖链等(3(。而糖蛋白糖链中根据糖链与蛋白质的连接方式不同，主要分为N糖链和O糖链。为了更好的分析和研究糖链，需要把糖链从糖蛋白上释放下来。因此，糖链的提取一直是糖组学研究关键所在。特别是如何从动物膳食肌肉组织中提取糖链，目前的研究并不广泛。而且糖链具有微观不均一性，所以很难分离得到结构完全相同的生物糖链(4(。由于其结构的复杂多样，分析方法有限，研究远滞后于蛋白链与核酸链(5(。本课题旨在研究如何从动物膳食肌肉组织中分离提取N糖链。
首先以鸡肌肉组织为研究对象，取鸡肉、鸡肝和鸡肾作为样品，提取糖蛋白。提取过程中使用了两种方法，一种是将样品用胃蛋白酶消化，之后过阳离子交换柱富集糖肽，再经过G25柱除盐的方法，另一种是向样品中直接加入三氯乙酸（TCA），使其蛋白质沉淀的方法。
然后，将两种方法提取的糖蛋白均采用酶法释放糖链。根据N糖链和O糖链糖肽键的不同，可采取不同的方法来释放糖链。N糖链是其糖蛋白中寡糖链的N乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）与蛋白质中的天冬酰胺的酰胺基相连，其分布相当广泛(6(。目前，N糖链的释放方法主要包括酶解法和化学释放法。化学释放法通常是在碱性条件下进行，会出现一些副反应，比如降解现象、去乙酰基和脱唾液酸等，使结果分析不完整(7((8(。因此，酶法是目前释放N糖链的常用方法。本实验采用 PNGase F 酶解释放 N糖链，它能酶解糖蛋白上天冬酰胺与乙酰葡萄糖胺基团之间的连接，该酶催化活性极高，适用于包括多种类型的N糖链如高甘露糖型、杂合型和复杂型糖链(9(。PNGase F 酶能释放除了核心N乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）被α 3岩藻糖基化的以外的所有类型的N糖链，是酶解N糖链最常用的酶((((。由于本实验使用的PNGase F酶为实验室自制的，所以要在使用之前先试验其活性。
最后，将经过碳柱纯化和2氨基苯甲酰胺（2AB）标记的样品用超高压液相色谱（UHPLC）法分离N糖链。通常，高效液相色谱（HPLC）是目前广泛使用的技术，它可以对糖链结构进行分离和鉴定。而与常规的HPLC法相比，本实验中所使用的UHPLC法具有更快的分析速度、更好的分离度和更高的灵敏度。
将得到图谱进行对比后得出结论，通过TCA法处理得到的糖蛋白具有含量损失少的优点，有利于后期对糖链做进一步的结构分析和功能研究。
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