加州鲈鱼腮部未知病原菌的分离鉴定(附件)
加州鲈是一种肉食性的淡水鱼类，原产于美洲，我国于1983年引进加州鲈鱼苗，因其肉质鲜美、生长快、经济价值较高而成为全国各地普遍养殖的特种水产品之一。近年来，随着养殖规模的不断扩大，集约化程度的不断提高以及池塘老化、水质环境污染、管理与技术措施滞后等诸多原因，新的病害不断涌现，有的已呈爆发趋势。本文主要从加州鲈鱼腮部分离了未知病害菌，使用形态观察、生理生化特性以及分子生物学方法对未知的致病菌鉴定，确定其致病菌的种属，并使用抗生素对其进行生物防治，为进一步研究其致病机制和防治方法提供依据。病鱼外观变化为体色加深，鳃孔、胸鳍、臀鳍充血发红，鳃丝充血，鳃丝黏液分泌增加且黏稠。从腮部病灶分离得到三株菌，均在LB培养基上生长迅速。生理生化实验结果表明三株菌的生长温度为 28-37 ℃，V-P 反应阴性，甲基红试验阴性，吲哚试验阴性，硫化氢实验阴性，柠檬酸盐利用实验阴性，能利用葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇，但不产气。对病原菌的 16S rDNA 序列对比分析及系统进化树分析表明，三株菌均与芽孢杆菌序列同源性最高，达 99%。药敏实验证实，菌株1、3对氯霉素、红霉素、硫酸新霉素、链霉素、盐酸壮观霉素均敏感，菌株2对链霉素、硫酸新霉素、盐酸壮观霉素敏感，对红霉素、氯霉素不敏感。关键词 加州鲈鱼，腮部病害，未知病害菌，鉴定
目 录
1 引言 1
1.1 加州鲈鱼 1
1.2 加州鲈鱼常见的病害 2
1.3 病原菌分离鉴定 3
1.4 研究意义及方法 4
2 试验材料 5
2.1 主要试剂 5
2.2 主要仪器 5
2.3 溶液与培养基 6
3 实验方法 7
3.1 病鱼外观观察 7
3.2 病原菌分离 7
3.3 革兰氏染色 8
3.4 生理生化实验 8
3.5 分子生物学鉴定 9
3.6 药敏实验 11
4 结果与讨论 11
4.1 病鱼观察 11
4.2 病原菌形态观察 12
4.3 生理生化实验 13
4.4 分子生物学鉴定 14
4.5 药敏实验 18
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
结 论 19
致 谢 20
参 考 文 献 21
附 录 23
1 引言
1.1 加州鲈鱼
1.1.1 养殖现状
加州鲈鱼学名大口黑鲈，属于肉食性鱼类，对动物性蛋白有很高的偏好性，在生长环境适宜的情况下，养殖 12 年的加州鲈鱼体重可达1.3 kg。鱼体侧扁纺锤形[1]，全身长有淡黄色细密鳞片，腹部灰白，背脊呈浅黑色，头部和背脊附近遍布黑色带状斑纹。原产于美洲的五大湖水域，于上世纪八十年代引进，因其生长速度快、肉质鲜美、市场价值高、不易患病等优良特性而被广泛养殖，因此鱼贪食，易上钩，也是发展游钓休闲渔业的品种。
现在我国最主要的养殖地区是广东，主要集中于佛山市的池塘精养，养殖面积约8万亩，年产23万吨，占全国总产量的60%。其次，是江浙地区，江苏的鲈鱼养殖主要集中于南京的高淳、溧水和苏州吴江区，养殖面积约4万亩，年产约4万吨，浙江的鲈鱼养殖主要在杭嘉湖地区，年产量与江苏相当。江浙地区的殖模式为套养大规格花白鲢鱼、黄颡鱼、花白鲢、鲫鱼或与河蟹混养模式养殖，取得较好的经济效益[2]。
近十年来加州鲈鱼的市场销售行情[3]十分稳定，成品鱼的成本在17元每千克左右，出塘价在25元每千克左右，留塘一年的鱼种到第二年四至七月再销售时，成本价高达25元每千克，出塘价约32元每千克。一般来说，加州鲈鱼在春冬季节（上市季节）价格较低，夏秋季节（淡季）价值就会高得多，七八月份鲈鱼均价高达36元每千克。
1.1.2 生长习性
在水质清洁，溶氧量在5 mg/L，透明度约30 cm的水中加州鲈鱼能够较为健康的生长。夏天养殖户应当勤开增氧机[4]，增强上下层水的对流，增加水中的氧含量。大量投喂饵料时易引起水质问题，应勤换水，定期使用生石灰泼洒鱼塘，使池水pH中性并使用益生制剂降低水中含氮物质的含量，保持水体流动、清洁。定期检测水温、含氧量、透明度、含氮物质含量，高温季节应增加检测频率。
投放饵料时应该根据鱼的争食情况及时增减饲料的投喂量，做到定时定点定量均匀投喂，初投饲料时应当慢、少，待鱼群集中后，再增大投喂量，待大多鱼吃饱之后，可减小投喂量及降低投喂速度。
1.2 加州鲈鱼常见的病害
虽然养殖技术日趋成熟，但在养殖密度过大，水中溶氧量过低，投饵过剩，水质污染的环境下，鲈鱼极易感染病原性疾病[5]。一般情况下，第一年养殖鲈鱼的池塘不易出现病害，经济效益较好。第二年开始，养殖池开始出现病害，诱因有虫害（车轮虫、杯体虫、孢子虫）、细菌性病害（白皮病、疖疮病、诺卡氏菌病、肠炎、烂身病）、病毒性病害（虹彩病毒、弹状病毒）。
1.2.1 白皮病
病原菌为白皮极毛杆菌，常产生于水质不佳或捕捞过程中鱼体受伤，此病主要见于5厘米以下的鱼种，发病时间在46月，且流行地区很广。发病初期表现为鱼鳍和尾部出现白点，并迅速蔓延至鱼鳍和尾部全部呈白色，严重时病鱼鳍部腐烂、眼膜发白失明，发病23天后病鱼即死亡。主要的防治方法为低浓度的漂白粉全池泼洒，发病初期的病鱼可以采用1015 min的2%3%食盐水浸泡并更换网箱[5]。
1.2.2 疖疮病
病原菌为疖疮型点状产气单胞杆菌，常见于鱼营养不良或盐浓度过高的水体，发病时间主要在59月。病鱼出现下皮肌肉组织溃烂，背部两侧出现溃荡状脓疮病灶，其中充满脓汁。主要的防治方法为用漂白粉对池塘进行彻底清塘消毒，苗种用2%3%的食盐水浸泡1530 min再下塘，定时向养殖池中泼洒生石灰，发病后全池泼洒强力杀菌消毒剂并用磺胺噻唑与饲料拌成药饵[6]。
1.2.3 烂鳃、烂嘴病
病原菌为柱状纤维粘细菌，此病主要出现在生长在养殖水温2330℃的成鱼和鱼种中，网箱中养殖的鲈鱼更易患烂鳃、烂嘴病。发病时间主要在59月。病鱼表现为腮丝颜色浅甚至呈白色，唇部表皮发炎溃烂，颌齿间上下的表皮发炎充血，严重情况下出现表皮糜烂脱落伴有淡黄色的菌团物。养殖过程中应注意保持适宜的放养密度和饲料投喂量，以保证水质。放鱼种之前先用漂白粉对池塘进行彻底清塘消毒，苗种用2%3%的食盐水浸泡1530 min再下塘。定期泼洒漂白粉对水体进行消毒，并用抗菌药物拌喂饵料[7]。
1.2.4 诺卡氏菌病
目 录
1 引言 1
1.1 加州鲈鱼 1
1.2 加州鲈鱼常见的病害 2
1.3 病原菌分离鉴定 3
1.4 研究意义及方法 4
2 试验材料 5
2.1 主要试剂 5
2.2 主要仪器 5
2.3 溶液与培养基 6
3 实验方法 7
3.1 病鱼外观观察 7
3.2 病原菌分离 7
3.3 革兰氏染色 8
3.4 生理生化实验 8
3.5 分子生物学鉴定 9
3.6 药敏实验 11
4 结果与讨论 11
4.1 病鱼观察 11
4.2 病原菌形态观察 12
4.3 生理生化实验 13
4.4 分子生物学鉴定 14
4.5 药敏实验 18
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
结 论 19
致 谢 20
参 考 文 献 21
附 录 23
1 引言
1.1 加州鲈鱼
1.1.1 养殖现状
加州鲈鱼学名大口黑鲈，属于肉食性鱼类，对动物性蛋白有很高的偏好性，在生长环境适宜的情况下，养殖 12 年的加州鲈鱼体重可达1.3 kg。鱼体侧扁纺锤形[1]，全身长有淡黄色细密鳞片，腹部灰白，背脊呈浅黑色，头部和背脊附近遍布黑色带状斑纹。原产于美洲的五大湖水域，于上世纪八十年代引进，因其生长速度快、肉质鲜美、市场价值高、不易患病等优良特性而被广泛养殖，因此鱼贪食，易上钩，也是发展游钓休闲渔业的品种。
现在我国最主要的养殖地区是广东，主要集中于佛山市的池塘精养，养殖面积约8万亩，年产23万吨，占全国总产量的60%。其次，是江浙地区，江苏的鲈鱼养殖主要集中于南京的高淳、溧水和苏州吴江区，养殖面积约4万亩，年产约4万吨，浙江的鲈鱼养殖主要在杭嘉湖地区，年产量与江苏相当。江浙地区的殖模式为套养大规格花白鲢鱼、黄颡鱼、花白鲢、鲫鱼或与河蟹混养模式养殖，取得较好的经济效益[2]。
近十年来加州鲈鱼的市场销售行情[3]十分稳定，成品鱼的成本在17元每千克左右，出塘价在25元每千克左右，留塘一年的鱼种到第二年四至七月再销售时，成本价高达25元每千克，出塘价约32元每千克。一般来说，加州鲈鱼在春冬季节（上市季节）价格较低，夏秋季节（淡季）价值就会高得多，七八月份鲈鱼均价高达36元每千克。
1.1.2 生长习性
在水质清洁，溶氧量在5 mg/L，透明度约30 cm的水中加州鲈鱼能够较为健康的生长。夏天养殖户应当勤开增氧机[4]，增强上下层水的对流，增加水中的氧含量。大量投喂饵料时易引起水质问题，应勤换水，定期使用生石灰泼洒鱼塘，使池水pH中性并使用益生制剂降低水中含氮物质的含量，保持水体流动、清洁。定期检测水温、含氧量、透明度、含氮物质含量，高温季节应增加检测频率。
投放饵料时应该根据鱼的争食情况及时增减饲料的投喂量，做到定时定点定量均匀投喂，初投饲料时应当慢、少，待鱼群集中后，再增大投喂量，待大多鱼吃饱之后，可减小投喂量及降低投喂速度。
1.2 加州鲈鱼常见的病害
虽然养殖技术日趋成熟，但在养殖密度过大，水中溶氧量过低，投饵过剩，水质污染的环境下，鲈鱼极易感染病原性疾病[5]。一般情况下，第一年养殖鲈鱼的池塘不易出现病害，经济效益较好。第二年开始，养殖池开始出现病害，诱因有虫害（车轮虫、杯体虫、孢子虫）、细菌性病害（白皮病、疖疮病、诺卡氏菌病、肠炎、烂身病）、病毒性病害（虹彩病毒、弹状病毒）。
1.2.1 白皮病
病原菌为白皮极毛杆菌，常产生于水质不佳或捕捞过程中鱼体受伤，此病主要见于5厘米以下的鱼种，发病时间在46月，且流行地区很广。发病初期表现为鱼鳍和尾部出现白点，并迅速蔓延至鱼鳍和尾部全部呈白色，严重时病鱼鳍部腐烂、眼膜发白失明，发病23天后病鱼即死亡。主要的防治方法为低浓度的漂白粉全池泼洒，发病初期的病鱼可以采用1015 min的2%3%食盐水浸泡并更换网箱[5]。
1.2.2 疖疮病
病原菌为疖疮型点状产气单胞杆菌，常见于鱼营养不良或盐浓度过高的水体，发病时间主要在59月。病鱼出现下皮肌肉组织溃烂，背部两侧出现溃荡状脓疮病灶，其中充满脓汁。主要的防治方法为用漂白粉对池塘进行彻底清塘消毒，苗种用2%3%的食盐水浸泡1530 min再下塘，定时向养殖池中泼洒生石灰，发病后全池泼洒强力杀菌消毒剂并用磺胺噻唑与饲料拌成药饵[6]。
1.2.3 烂鳃、烂嘴病
病原菌为柱状纤维粘细菌，此病主要出现在生长在养殖水温2330℃的成鱼和鱼种中，网箱中养殖的鲈鱼更易患烂鳃、烂嘴病。发病时间主要在59月。病鱼表现为腮丝颜色浅甚至呈白色，唇部表皮发炎溃烂，颌齿间上下的表皮发炎充血，严重情况下出现表皮糜烂脱落伴有淡黄色的菌团物。养殖过程中应注意保持适宜的放养密度和饲料投喂量，以保证水质。放鱼种之前先用漂白粉对池塘进行彻底清塘消毒，苗种用2%3%的食盐水浸泡1530 min再下塘。定期泼洒漂白粉对水体进行消毒，并用抗菌药物拌喂饵料[7]。
1.2.4 诺卡氏菌病
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