犬瘟热亚单位疫苗免疫保护力评价
犬瘟热（canine distemper，CD）是一种由犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)引起的犬科动物、毛皮动物养殖业和其他肉食动物易感的高度致死性的急性病毒病，是当前对养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护危害最大的疫病之一。本试验通过培养PK15细胞，富集以马疱疹病毒疫苗株作为活病毒载体表达犬瘟热囊膜蛋白（H、N蛋白）的重组Rach-CDVH和Rach-CDVN，测定病毒Rach-CDVH滴度5.6×105PFU/ml、Rach-CDVN 滴度8.2×106PFU/ml后，免疫每只新西兰白兔后收获高免血清。从临床病例中分离犬瘟热病毒，以实验室保存的犬瘟热毒株5804作为平行对照，建立病毒中和试验。实验结果显示初次免疫体内抗体效价为1:56 ，加强免疫后体内抗体效价水平为1:224，表明重组病毒免疫动物后能够产生有效的免疫保护力。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 1
引言 1
1材料与方法 2
1.1材料 2
1.1.1细胞、病毒、血清、实验动物2
1.1.2 试剂 2
1.1.3 试验设备 2
1.2方法 2
1.2.1 复苏培养PK15细胞2
1.2.2富集病毒液提取病毒蛋白3
1.2.3 western blot检测H与N蛋白的表达 3
1.2.4 CDV病毒液的分离3
1.2.5测定病毒液滴度4
1.2.6免疫家兔及抗血清的制备4
1.2.7 病毒中和实验测定兔抗血清效价4
2 结果与分析4
2.1重组转移载体RachH和RachN在PK15细胞中的感染结果4
2.2 Western blot检测H和N蛋白的表达结果5
2.3病毒液PFU测定结果6
2.4 兔抗血清CDV中和实验结果6
3讨论 7
致谢8
参考文献8
犬瘟热亚单位疫苗免疫保护力评价 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
引言
犬瘟热（canine distemper，CD）是一种由犬瘟热病毒(canine distemper virus, CDV)引起的犬科动物、毛皮动物养殖业和其他肉食动物易感的高度致死性的急性病毒病[1]，是当前对养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护危害最大的疫病之一[2]。其主要特征为出现双相体温升高、白细胞减少、急性卡他、结膜炎、支气管炎、卡他性肺炎、胃肠炎、皮炎及神经症状，其病原体CDV 为不分节段的单股负链 RNA 病毒，基因组呈线性排列，编码的蛋白主要有 N 、P、M、F、H 和 L 六种。其中N 蛋白（核衣壳蛋白）是麻疹病毒属中的主要交叉抗原，其分子量为58 kDa，具有包裹和保护内部基因的功能。H 蛋白（血凝素蛋白）是诱导机体产生中和抗体的重要抗原，分子量为76～85 kDa，为 CDV 囊膜表面 II 型糖蛋白，决定了 CDV 宿主的特异性，并协助 F 蛋白使 CDV 以囊膜与宿主细胞膜发生融合的方式进入宿主细胞。该病分布于全世界，我国也时有发生且近几年发病率有升高趋势[3] 在该病的诊断方面，建立了包括病毒分离鉴定、血清学、分子生物学等方法；在防治方面，开展了灭活疫苗，基因工程疫苗的研究；在治疗方面，研制了高兔血清、干扰素等。
本次实验通过在已构建好表达犬瘟热囊膜蛋白（H、N）蛋白的活病毒载体并检测其蛋白正确表达的基础上，将富集的RachCDVH以及RachCDVN免疫实验动物，建立病毒中和实验的方法，检测免疫家兔后其体内抗体的效价水平，评价其疫苗株的免疫保护力，为今后CDV的诊断以及防治提供一定的数据参考。CD在全世界分布广泛，因其可以在不同物种间交叉感染，目前尚无特效的药物与方法可以控制该病情的发展，所以疫苗接种就成了唯一有效的防控措施。各种不同类型的疫苗通过刺激机体而产生免疫保护,从而阻止病毒的增殖。常规疫苗自Puntion首次应用CDV感染犬脑组织的福尔马林灭活苗以来,相继研制出不同类型的CDV灭活苗、麻疹病毒异源苗(MV)和CDV弱毒疫苗等[4]。近年来,人们已研制包括CDV重组活苗、基因工程亚单位多呋苗以及核疫苗在内的新型疫苗,以克服常规疫苗的不足。人们研究发现，CDV基因中诱导的H和N蛋白的重组疫苗可有效防控CDV并保护机体[5]。人们开始更多关注此类蛋白以及相关疫苗的研制。
1 材料与方法
1．1 材料
1.1.1细胞、病毒、血清、实验动物 PK15猪肾细胞、Vero slam细胞、犬瘟热疫苗毒株5804、RachCDVH和RachCDVN的病毒液、携带绿色荧光蛋白基因的Rach 53菌株（DH10B）均由本实验室保存；临床病例分离所得CDV病毒液由农科院提供；CDV阴性对照为健康新西兰白兔血清；CDV阳性对照为注射CDV病毒的白兔血清；待测血清为CDV弱毒亚单位疫苗免疫兔血清；新西兰白兔购自南京青龙山实验动物公司。
1.1.2 试剂 DMEM细胞培养液为HyClone 公司产品；MEM细胞培养液为宏伟生物技术有限公司产品；胰酶为Gbico公司产品；胎牛血清为Invitrogen公司产品；PBS为HyClone 公司产品；二甲基亚砜为南京鼎思生物技术公司产品；低熔点琼脂糖（LMP）、结晶紫、十二烷基磺酸钠（SDS）、蛋白酶K、无水乙醇、NaHCO3、等均为分析纯，购自Sigma公司以及南京鼎思生物技术公司。电泳用试剂、mixture I、mixture II、lysis buffer等自配。
1.1.3 试验设备 低温离心机、CO2细胞培养箱为Thermo Scientific公司产品；倒置显微镜为Olympus产品；曝光机购自BioRad公司；荧光显微镜为ZEISS公司产品；水浴锅为上海精宏公司产品。
1．2 方法
1.2.1 复苏培养PK15细胞
从液氮罐中慢慢取出PK15细胞；将取出的冻存管立即投入37℃的水浴锅中，液体融化后，离心1000rpm，5min；看管底有沉淀物后，用大枪吸走上清，尽量在极短的时间内加入1ml新鲜培养基（DMEM+10%FCS）；轻柔吹匀细胞沉淀，再加入1ml后转培养瓶（总5ml），再加入适量培养液，轻柔吹打；放在倒置显微镜下观察有无细胞团块，若有细胞团块还需继续吹打，若无则置于37℃，5%培养箱中培养；第二天观察细胞的生长情况（更换成新的培养液）；3天后将贴壁细胞消化，更换培养液。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 1
引言 1
1材料与方法 2
1.1材料 2
1.1.1细胞、病毒、血清、实验动物2
1.1.2 试剂 2
1.1.3 试验设备 2
1.2方法 2
1.2.1 复苏培养PK15细胞2
1.2.2富集病毒液提取病毒蛋白3
1.2.3 western blot检测H与N蛋白的表达 3
1.2.4 CDV病毒液的分离3
1.2.5测定病毒液滴度4
1.2.6免疫家兔及抗血清的制备4
1.2.7 病毒中和实验测定兔抗血清效价4
2 结果与分析4
2.1重组转移载体RachH和RachN在PK15细胞中的感染结果4
2.2 Western blot检测H和N蛋白的表达结果5
2.3病毒液PFU测定结果6
2.4 兔抗血清CDV中和实验结果6
3讨论 7
致谢8
参考文献8
犬瘟热亚单位疫苗免疫保护力评价 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
引言
犬瘟热（canine distemper，CD）是一种由犬瘟热病毒(canine distemper virus, CDV)引起的犬科动物、毛皮动物养殖业和其他肉食动物易感的高度致死性的急性病毒病[1]，是当前对养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护危害最大的疫病之一[2]。其主要特征为出现双相体温升高、白细胞减少、急性卡他、结膜炎、支气管炎、卡他性肺炎、胃肠炎、皮炎及神经症状，其病原体CDV 为不分节段的单股负链 RNA 病毒，基因组呈线性排列，编码的蛋白主要有 N 、P、M、F、H 和 L 六种。其中N 蛋白（核衣壳蛋白）是麻疹病毒属中的主要交叉抗原，其分子量为58 kDa，具有包裹和保护内部基因的功能。H 蛋白（血凝素蛋白）是诱导机体产生中和抗体的重要抗原，分子量为76～85 kDa，为 CDV 囊膜表面 II 型糖蛋白，决定了 CDV 宿主的特异性，并协助 F 蛋白使 CDV 以囊膜与宿主细胞膜发生融合的方式进入宿主细胞。该病分布于全世界，我国也时有发生且近几年发病率有升高趋势[3] 在该病的诊断方面，建立了包括病毒分离鉴定、血清学、分子生物学等方法；在防治方面，开展了灭活疫苗，基因工程疫苗的研究；在治疗方面，研制了高兔血清、干扰素等。
本次实验通过在已构建好表达犬瘟热囊膜蛋白（H、N）蛋白的活病毒载体并检测其蛋白正确表达的基础上，将富集的RachCDVH以及RachCDVN免疫实验动物，建立病毒中和实验的方法，检测免疫家兔后其体内抗体的效价水平，评价其疫苗株的免疫保护力，为今后CDV的诊断以及防治提供一定的数据参考。CD在全世界分布广泛，因其可以在不同物种间交叉感染，目前尚无特效的药物与方法可以控制该病情的发展，所以疫苗接种就成了唯一有效的防控措施。各种不同类型的疫苗通过刺激机体而产生免疫保护,从而阻止病毒的增殖。常规疫苗自Puntion首次应用CDV感染犬脑组织的福尔马林灭活苗以来,相继研制出不同类型的CDV灭活苗、麻疹病毒异源苗(MV)和CDV弱毒疫苗等[4]。近年来,人们已研制包括CDV重组活苗、基因工程亚单位多呋苗以及核疫苗在内的新型疫苗,以克服常规疫苗的不足。人们研究发现，CDV基因中诱导的H和N蛋白的重组疫苗可有效防控CDV并保护机体[5]。人们开始更多关注此类蛋白以及相关疫苗的研制。
1 材料与方法
1．1 材料
1.1.1细胞、病毒、血清、实验动物 PK15猪肾细胞、Vero slam细胞、犬瘟热疫苗毒株5804、RachCDVH和RachCDVN的病毒液、携带绿色荧光蛋白基因的Rach 53菌株（DH10B）均由本实验室保存；临床病例分离所得CDV病毒液由农科院提供；CDV阴性对照为健康新西兰白兔血清；CDV阳性对照为注射CDV病毒的白兔血清；待测血清为CDV弱毒亚单位疫苗免疫兔血清；新西兰白兔购自南京青龙山实验动物公司。
1.1.2 试剂 DMEM细胞培养液为HyClone 公司产品；MEM细胞培养液为宏伟生物技术有限公司产品；胰酶为Gbico公司产品；胎牛血清为Invitrogen公司产品；PBS为HyClone 公司产品；二甲基亚砜为南京鼎思生物技术公司产品；低熔点琼脂糖（LMP）、结晶紫、十二烷基磺酸钠（SDS）、蛋白酶K、无水乙醇、NaHCO3、等均为分析纯，购自Sigma公司以及南京鼎思生物技术公司。电泳用试剂、mixture I、mixture II、lysis buffer等自配。
1.1.3 试验设备 低温离心机、CO2细胞培养箱为Thermo Scientific公司产品；倒置显微镜为Olympus产品；曝光机购自BioRad公司；荧光显微镜为ZEISS公司产品；水浴锅为上海精宏公司产品。
1．2 方法
1.2.1 复苏培养PK15细胞
从液氮罐中慢慢取出PK15细胞；将取出的冻存管立即投入37℃的水浴锅中，液体融化后，离心1000rpm，5min；看管底有沉淀物后，用大枪吸走上清，尽量在极短的时间内加入1ml新鲜培养基（DMEM+10%FCS）；轻柔吹匀细胞沉淀，再加入1ml后转培养瓶（总5ml），再加入适量培养液，轻柔吹打；放在倒置显微镜下观察有无细胞团块，若有细胞团块还需继续吹打，若无则置于37℃，5%培养箱中培养；第二天观察细胞的生长情况（更换成新的培养液）；3天后将贴壁细胞消化，更换培养液。
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