灵芝tor基因沉默对生长发育和次级代谢的影响研究
灵芝(Ganoderma lucidum)是一种具有极高药用价值的真菌，具有广泛的开发前景。TOR是雷帕霉素目标蛋白，在生物体细胞中有着重要作用。本课题针对tor基因沉默的灵芝菌丝体以及不同浓度雷帕霉素培养的野生型灵芝菌丝体，分别对其生长状况、菌丝形态、胞内灵芝三萜含量、菌丝内ROS、Ca2+含量的变化情况进行研究，发现和野生型相比，tor沉默转化的灵芝菌丝体出现生长缓慢、菌丝尖端分叉距离增大、胞内三萜含量上升，ROS和Ca2+的含量上升的现象。同时，高浓度的雷帕霉素培养下的野生型灵芝菌丝体，出现了相似现象，且随着浓度的增加这些现象更加明显。这些实验结果表明了，tor基因沉默以及雷帕霉素都对灵芝TOR蛋白的正常生物学活性有一定抑制作用。这将对于灵芝的TOR蛋白功能以及其相关基因的研究具有重要的意义。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1实验菌株2
1.1.2实验试剂2
1.1.3实验仪器2
1.2 方法 2
1.2.1 tor沉默转化子接种 2
1.2.2 野生型灵芝菌丝接种于雷帕霉素浓度梯度培养基2
1.2.3 生长量测量 2
1.2.4 菌丝尖端相邻分叉点距离测量 3
1.2.5 菌丝内活性氧含量测定 3
1.2.6 菌丝内Ca2+含量测定 3
1.2.7 菌丝内三萜含量测定 3
2 结果与分析3
2.1 TOR沉默转化子研究结果3
2.1.1 生长量测量结果3
2.1.2 菌丝尖端相邻分叉点距离测量结果4
2.1.3 菌丝内活性氧含量测定结果4
2.1.4 菌丝内Ca2+含量测定结果5
2.1.5 菌丝内三萜含量测定结果6
2.2 雷帕霉素浓度对菌丝体生长影响研究结果6
2.2.1 生长量测量结果6
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
2.2.2 菌丝尖端相邻分叉点距离测量结果7
2.2.3 菌丝内活性氧含量测定结果8
2.2.4 菌丝内Ca2+含量测定结果8
2.2.5 菌丝内三萜含量测定结果9
3 讨论10
致谢11
参考文献11
灵芝TOR基因沉默对生长发育和次生代谢的影响研究
引言
引言
研究表明，人们已从灵芝中分离到包括多糖、生物碱、三萜、甾醇等十几类物质。三萜类化合物又称灵芝酸，是灵芝的主要化学成分。灵芝同时还含有多种微量元素和人体必需氨基酸。对这些成分进行分离、提纯以及进一步加工，所制备产物具有极高的药用价值。
灵芝具有众多重要保健作用，使用灵芝相关药物，可达到抗衰老、镇静安神、抗氧化及提高机体免疫力等作用。同时在神经衰弱、糖尿病、高血压、慢性肝炎等多种疾病的治疗中得到广泛应用[1]。
灵芝在药学史上一直享有崇高的地位，在中国和其它亚洲国家的使用历史已有二千多年。
近年来，世界范围内灵芝相关产品的消费需求量迅速上升[2]。中国作为灵芝和灵芝制品的生产大国，在灵芝市场中占据举足轻重的地位。多种灵芝相关专利产品也不断出现[3]。灵芝药品制剂还被用于抗肿瘤、减少放、化疗毒副等方面。这些现象表明灵芝的生产应用前景不可小觑，对灵芝生长生理特性的研究可对其生产产生指导性作用，具有深远意义。
雷帕霉素(Rapmaycin, RAPA)，是一种三烯大环内酯类抗生素[4]。雷帕霉素是TOR蛋白的活性抑制剂[5]。近年来，雷帕霉素被发现是肾毒性最低的一种免疫抑制剂，已在临床上被开发为新型抗排斥药物应用于器官移植治疗。
TOR（target of rapamycin）即雷帕霉素目标蛋白，能够在数量和质量上调整蛋白合成和降解之间的平衡，可对翻译的进行、停终止以及多条代谢通路中不同酶生产进行控制[6] 。
tor基因广泛存在于各种生物细胞中。TOR蛋白在真菌生长代谢中有着重要作用。对真菌tor转化子的研究预期会对相关真菌生产以及三萜等有机物含量的改善有指导性作用[7]。然而，目前世界范围内对灵芝中TOR蛋白的作用、TOR蛋白信号通路及其调控信号、tor基因的相关特性的研究甚少。
本课题通过对RNA沉默技术[8]构建的tor基因沉默灵芝菌株的各种生理生化指标进行研究，为未来对灵芝中tor基因以及TOR蛋白的相关功能进行进一步研究奠定了基础，对灵芝栽培以及新型药物的开发具有重要的理论和现实指导意义。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 实验菌株
灵芝（Ganoderma lucidum）菌株G20由本实验室保藏。
1．1．2 实验试剂
荧光增白剂、DCFHDA染液（用于ROS染色）、Fluo3AM染液（用于Ca2+染色）、雷帕霉素、香草醛、高氯酸、冰醋酸等。
1．1．3 实验仪器
荧光显微镜，超声波破碎仪，离心机，28℃摇床，28℃培养箱，分光光度计，烘箱，超净工作台等。
1．2 实验方法
1.2.1 tor基因沉默转化子
配制CYM培养基，分装于若干150mL的三角瓶中。
进行培养基灭菌。每瓶培养基倒3块培养皿。
用打孔器在长有Wild Type、CK1、CK2、tori1、tori8、tori12的培养皿上打孔，分别接种到各个培养基上，在接种中心的四周倾斜一定角度以于接种圆片相切方向插盖玻片。（CK为转入空载质粒的菌丝体）
放入28℃培养箱中培养，观察菌丝生长情况。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1实验菌株2
1.1.2实验试剂2
1.1.3实验仪器2
1.2 方法 2
1.2.1 tor沉默转化子接种 2
1.2.2 野生型灵芝菌丝接种于雷帕霉素浓度梯度培养基2
1.2.3 生长量测量 2
1.2.4 菌丝尖端相邻分叉点距离测量 3
1.2.5 菌丝内活性氧含量测定 3
1.2.6 菌丝内Ca2+含量测定 3
1.2.7 菌丝内三萜含量测定 3
2 结果与分析3
2.1 TOR沉默转化子研究结果3
2.1.1 生长量测量结果3
2.1.2 菌丝尖端相邻分叉点距离测量结果4
2.1.3 菌丝内活性氧含量测定结果4
2.1.4 菌丝内Ca2+含量测定结果5
2.1.5 菌丝内三萜含量测定结果6
2.2 雷帕霉素浓度对菌丝体生长影响研究结果6
2.2.1 生长量测量结果6
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
2.2.2 菌丝尖端相邻分叉点距离测量结果7
2.2.3 菌丝内活性氧含量测定结果8
2.2.4 菌丝内Ca2+含量测定结果8
2.2.5 菌丝内三萜含量测定结果9
3 讨论10
致谢11
参考文献11
灵芝TOR基因沉默对生长发育和次生代谢的影响研究
引言
引言
研究表明，人们已从灵芝中分离到包括多糖、生物碱、三萜、甾醇等十几类物质。三萜类化合物又称灵芝酸，是灵芝的主要化学成分。灵芝同时还含有多种微量元素和人体必需氨基酸。对这些成分进行分离、提纯以及进一步加工，所制备产物具有极高的药用价值。
灵芝具有众多重要保健作用，使用灵芝相关药物，可达到抗衰老、镇静安神、抗氧化及提高机体免疫力等作用。同时在神经衰弱、糖尿病、高血压、慢性肝炎等多种疾病的治疗中得到广泛应用[1]。
灵芝在药学史上一直享有崇高的地位，在中国和其它亚洲国家的使用历史已有二千多年。
近年来，世界范围内灵芝相关产品的消费需求量迅速上升[2]。中国作为灵芝和灵芝制品的生产大国，在灵芝市场中占据举足轻重的地位。多种灵芝相关专利产品也不断出现[3]。灵芝药品制剂还被用于抗肿瘤、减少放、化疗毒副等方面。这些现象表明灵芝的生产应用前景不可小觑，对灵芝生长生理特性的研究可对其生产产生指导性作用，具有深远意义。
雷帕霉素(Rapmaycin, RAPA)，是一种三烯大环内酯类抗生素[4]。雷帕霉素是TOR蛋白的活性抑制剂[5]。近年来，雷帕霉素被发现是肾毒性最低的一种免疫抑制剂，已在临床上被开发为新型抗排斥药物应用于器官移植治疗。
TOR（target of rapamycin）即雷帕霉素目标蛋白，能够在数量和质量上调整蛋白合成和降解之间的平衡，可对翻译的进行、停终止以及多条代谢通路中不同酶生产进行控制[6] 。
tor基因广泛存在于各种生物细胞中。TOR蛋白在真菌生长代谢中有着重要作用。对真菌tor转化子的研究预期会对相关真菌生产以及三萜等有机物含量的改善有指导性作用[7]。然而，目前世界范围内对灵芝中TOR蛋白的作用、TOR蛋白信号通路及其调控信号、tor基因的相关特性的研究甚少。
本课题通过对RNA沉默技术[8]构建的tor基因沉默灵芝菌株的各种生理生化指标进行研究，为未来对灵芝中tor基因以及TOR蛋白的相关功能进行进一步研究奠定了基础，对灵芝栽培以及新型药物的开发具有重要的理论和现实指导意义。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 实验菌株
灵芝（Ganoderma lucidum）菌株G20由本实验室保藏。
1．1．2 实验试剂
荧光增白剂、DCFHDA染液（用于ROS染色）、Fluo3AM染液（用于Ca2+染色）、雷帕霉素、香草醛、高氯酸、冰醋酸等。
1．1．3 实验仪器
荧光显微镜，超声波破碎仪，离心机，28℃摇床，28℃培养箱，分光光度计，烘箱，超净工作台等。
1．2 实验方法
1.2.1 tor基因沉默转化子
配制CYM培养基，分装于若干150mL的三角瓶中。
进行培养基灭菌。每瓶培养基倒3块培养皿。
用打孔器在长有Wild Type、CK1、CK2、tori1、tori8、tori12的培养皿上打孔，分别接种到各个培养基上，在接种中心的四周倾斜一定角度以于接种圆片相切方向插盖玻片。（CK为转入空载质粒的菌丝体）
放入28℃培养箱中培养，观察菌丝生长情况。
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