响应曲面优化蛋白酶酶解制备南极磷虾油工艺研究
摘要：本文旨在研究酶解法提取南极磷虾油，首先通过单因素试验研究酶的种类、酶添加量、酶解时间以及酶解温度对南极磷虾油提取率的影响，得出复合蛋白酶酶解效果最好。选择酶添加量、酶解时间和酶解温度为主要因素，采用响应曲面法进行工艺优化，最后得出最佳酶解条件为：酶添加量0.14%，酶解时间2.9h，酶解温度44.9℃，此条件下南极磷虾油提取率可达到85.13%。所得南极磷虾油饱和脂肪酸的含量为36.9%。不饱和脂肪酸含量为63.1%，其中单不饱和脂肪酸占40.7%，多不饱和脂肪酸占59.3%；EPA含量为15.69%，DHA含量为13.66%。
目录
摘要4
关键词4
Abstract4
Key words4
引言5
1.材料与方法6
1.1.材料与试剂 6
1.2.仪器与设备 6
1.3.实验方法6
1.3.1.南极磷虾总脂质测定方法6
1.3.2.南极磷虾油提取方法6
1.3.3.南极磷虾油提取率的计算方法7
1.3.4.南极磷虾油脂肪酸测定方法7
1.3.5.单因素试验7
1.3.5.1.酶种类的选择7
1.3.5.2.原料选择7
1.3.5.3.酶添加量的选择8
1.3.5.4.酶解时间的选择8
1.3.5.5.酶解温度的选择8
1.3.6.响应曲面优化试验8
2.结果与分析8
2.1.南极虾油总脂质测定结果8
2.2.单因素实验结果8
2.2.1.酶种类对虾油提取率的影响8
2.2.2.原料选择9
2.2.3.酶添加量对虾油提取率的影响9
2.2.4.酶解时间对虾油提取率的影响9
2.2.5.酶解温度对虾油提取率的影响10
2.3.响应曲面优化试验结果10
2.3.1.模型的建立10
2.3.2.响应曲面分析11
2.3.3.验证试验12
2.4.虾油脂肪酸分析结果13
3.讨论14
/> 致谢14
参考文献15
响应曲面优化蛋白酶酶解制备南极磷虾油工艺研究
引言
南极磷虾是一种生物量极大的小虾，其分布在南大洋南极辐合区以南的南极海域[1]。据估计，磷虾的资源量为1.25亿7.25亿吨[2]，由于南极磷虾所处的特殊环境，使其拥有了许多生物学特性，因此南极磷虾的开发及其附加产品都备受人们关注。南极磷虾富含氨基酸种类丰富的蛋白质，脂肪含量较少，但含有丰富的多不饱和脂肪酸，尤其是EPA和DHA。南极磷虾油因其成分组成含有多种生理功能。
南极磷虾油具有抗氧化功能，可降低心脑血管疾病的风险。王亚恩[3]采用无水乙醇浸提法从南极磷虾粉中提取南极磷虾油并开展了相关功能特性实验。研究结果表明，南极磷虾油对高脂血症大鼠具有较好的降脂作用和抗氧化作用，同时具有改善大鼠学习记忆的功能； Bunea[4] 研究结果显示，磷虾油在改善血脂和脂蛋白方面较鱼油更有营养学意义；综上所述，南极磷虾油在预防心血管疾病、促进大脑发育、提高记忆力、延缓衰老、缓解痛风和类风湿关节炎等方面具有显著功效。因此南极磷虾油的提取一直以来都是研究的热点。
目前南极磷虾油的主要提取方法包括有机溶剂提取法，酶解法，超临界CO2提取法。溶剂提取法提取脂质得率较高，不同溶剂提取的脂质成分有差别。有关溶剂法提取虾油的研究较多，赵传凯等[5]使用无水乙醇，在提取温度为 65 ℃，时间为 3 h，料液比为 1:9（w/v）的条件下，提取南极磷虾虾粉中的油脂，油脂提取率为19．6％,其中不饱和脂肪酸占 34.73%，饱和脂肪酸占 65.26%，该方法提取油脂在保证油脂得率的情况下需满足高温、高料液比、长时提取等条件，从工业化生产成本、成产效率及安全性角度考虑，不利于工业化生产。郭休玉[6]以南极磷虾粉为原料，先以料液比1:8加入乙醇搅拌提取2h，提取液过滤，分离得到提取液和残渣; 再将残渣以料液比1:6 加入乙醇搅拌提取2h，过滤，两次提取液合并。油脂得率为15.72%，两次提取效果显著，两步提取法的提取率很高，但操作过程繁琐，不宜大规模工业化应用。
超临界CO2提取法萃取技术是提取脂质的一种较温和方法，得到的脂质基本成分与氯仿甲醇近似，试剂用量少，生产时间短，安全性更高，但成本过高；超临界流体具有高渗透性和高溶解能力，是现代食品加工高新的分离技术。其中超临界流体指的是超过其临界压力和临界温度状态下的流体，它具有低粘度、低离子扩散系数和高密度的特点，对多种成分具有较强的分离能力[7]。超临界CO2法在虾油的提取方面研究较少。 孙甜甜[8]采用超临界CO2提取法提取南极磷虾脂质，油脂得率随着萃取时间的延长逐渐升高，萃取3h后，提取率达到17.53%，与溶剂萃取法的得率相近。
酶解法作为生物方法，安全性较溶剂法高。其作用原理是通过酶解作用使脂类与复合的蛋白质、多糖分离开，从而促使油脂的释放。酶解法与传统提取方法相比有以下优点：（1）提取方法为生物法，条件温和，所得虾油品质优；（2）原料不需要干燥，适合高水分含量的原料；（3）所需能量少，又能提高下脚料如蛋白质等的进一步利用。有关酶解法提取虾油的国内外研究如下：
J. Dumay 等[9]使用不同工业蛋白酶从沙丁鱼内脏中回收油脂和磷脂，并且分别分析了沉淀层、水相层和油层的成分，研究表明酶解作用增加了蛋白质的溶解性，油脂主要集中在油层和水相层，而且这些油脂中磷脂的含量比有机溶剂法提取的含量高。
周长平[10]用先添加中性蛋白酶再添加碱性蛋白酶的酶解方法得出虾油提取率为73.42%，其中不饱和脂肪酸含量达到 68.93%，明显高于有机溶剂提取的粗油（51.29%）；EPA和DHA的含量达到21.84%和 9.54%，也明显高于有机溶剂提取的粗油（EPA13.58%、DHA5.63%）。经过精炼后两种方法得到的虾油的脂肪酸含量趋于接近。
徐晓斌[11]以复合蛋白酶为工具酶，研究采用酶解法从南极磷虾中提取油脂，最佳酶解条件为：中性环境，酶用量0.13%，酶解温度43.8℃，酶解时间4.9h；在此条件下，南极磷虾油提取率为96.06%。
周长平等[12]采用酶解法结合溶剂萃取从南极磷虾中提取虾油，先加碱性蛋白酶酶解，再加入中性蛋白酶酶解，该法虾油的提取率为64.52%，提取的虾油酸值（KOH）为61.07mg/g，碘值（I）为157.87g/100g,过氧化值0.45mmol/kg,水分及挥发物0.84%，不皂化物0.64%，不溶性杂质0.09%，不饱和脂肪酸含量达到71.42%，其中EPA为9.82%，DHA为21.97%，具有很高的营养价值。
本研究在原有研究基础上主要探讨不同酶对虾油提取率的影响,寻找最佳酶，进而通过单因素试验讨论酶添加量、酶作用时间以及酶作用温度对虾油提取率的影响，最终通过响应曲面试验优化，得到最佳的实验条件，形成一套完整的、高效的、安全的虾油提取方法。
1 材料与方法
1．1 材料与试剂
目录
摘要4
关键词4
Abstract4
Key words4
引言5
1.材料与方法6
1.1.材料与试剂 6
1.2.仪器与设备 6
1.3.实验方法6
1.3.1.南极磷虾总脂质测定方法6
1.3.2.南极磷虾油提取方法6
1.3.3.南极磷虾油提取率的计算方法7
1.3.4.南极磷虾油脂肪酸测定方法7
1.3.5.单因素试验7
1.3.5.1.酶种类的选择7
1.3.5.2.原料选择7
1.3.5.3.酶添加量的选择8
1.3.5.4.酶解时间的选择8
1.3.5.5.酶解温度的选择8
1.3.6.响应曲面优化试验8
2.结果与分析8
2.1.南极虾油总脂质测定结果8
2.2.单因素实验结果8
2.2.1.酶种类对虾油提取率的影响8
2.2.2.原料选择9
2.2.3.酶添加量对虾油提取率的影响9
2.2.4.酶解时间对虾油提取率的影响9
2.2.5.酶解温度对虾油提取率的影响10
2.3.响应曲面优化试验结果10
2.3.1.模型的建立10
2.3.2.响应曲面分析11
2.3.3.验证试验12
2.4.虾油脂肪酸分析结果13
3.讨论14
/> 致谢14
参考文献15
响应曲面优化蛋白酶酶解制备南极磷虾油工艺研究
引言
南极磷虾是一种生物量极大的小虾，其分布在南大洋南极辐合区以南的南极海域[1]。据估计，磷虾的资源量为1.25亿7.25亿吨[2]，由于南极磷虾所处的特殊环境，使其拥有了许多生物学特性，因此南极磷虾的开发及其附加产品都备受人们关注。南极磷虾富含氨基酸种类丰富的蛋白质，脂肪含量较少，但含有丰富的多不饱和脂肪酸，尤其是EPA和DHA。南极磷虾油因其成分组成含有多种生理功能。
南极磷虾油具有抗氧化功能，可降低心脑血管疾病的风险。王亚恩[3]采用无水乙醇浸提法从南极磷虾粉中提取南极磷虾油并开展了相关功能特性实验。研究结果表明，南极磷虾油对高脂血症大鼠具有较好的降脂作用和抗氧化作用，同时具有改善大鼠学习记忆的功能； Bunea[4] 研究结果显示，磷虾油在改善血脂和脂蛋白方面较鱼油更有营养学意义；综上所述，南极磷虾油在预防心血管疾病、促进大脑发育、提高记忆力、延缓衰老、缓解痛风和类风湿关节炎等方面具有显著功效。因此南极磷虾油的提取一直以来都是研究的热点。
目前南极磷虾油的主要提取方法包括有机溶剂提取法，酶解法，超临界CO2提取法。溶剂提取法提取脂质得率较高，不同溶剂提取的脂质成分有差别。有关溶剂法提取虾油的研究较多，赵传凯等[5]使用无水乙醇，在提取温度为 65 ℃，时间为 3 h，料液比为 1:9（w/v）的条件下，提取南极磷虾虾粉中的油脂，油脂提取率为19．6％,其中不饱和脂肪酸占 34.73%，饱和脂肪酸占 65.26%，该方法提取油脂在保证油脂得率的情况下需满足高温、高料液比、长时提取等条件，从工业化生产成本、成产效率及安全性角度考虑，不利于工业化生产。郭休玉[6]以南极磷虾粉为原料，先以料液比1:8加入乙醇搅拌提取2h，提取液过滤，分离得到提取液和残渣; 再将残渣以料液比1:6 加入乙醇搅拌提取2h，过滤，两次提取液合并。油脂得率为15.72%，两次提取效果显著，两步提取法的提取率很高，但操作过程繁琐，不宜大规模工业化应用。
超临界CO2提取法萃取技术是提取脂质的一种较温和方法，得到的脂质基本成分与氯仿甲醇近似，试剂用量少，生产时间短，安全性更高，但成本过高；超临界流体具有高渗透性和高溶解能力，是现代食品加工高新的分离技术。其中超临界流体指的是超过其临界压力和临界温度状态下的流体，它具有低粘度、低离子扩散系数和高密度的特点，对多种成分具有较强的分离能力[7]。超临界CO2法在虾油的提取方面研究较少。 孙甜甜[8]采用超临界CO2提取法提取南极磷虾脂质，油脂得率随着萃取时间的延长逐渐升高，萃取3h后，提取率达到17.53%，与溶剂萃取法的得率相近。
酶解法作为生物方法，安全性较溶剂法高。其作用原理是通过酶解作用使脂类与复合的蛋白质、多糖分离开，从而促使油脂的释放。酶解法与传统提取方法相比有以下优点：（1）提取方法为生物法，条件温和，所得虾油品质优；（2）原料不需要干燥，适合高水分含量的原料；（3）所需能量少，又能提高下脚料如蛋白质等的进一步利用。有关酶解法提取虾油的国内外研究如下：
J. Dumay 等[9]使用不同工业蛋白酶从沙丁鱼内脏中回收油脂和磷脂，并且分别分析了沉淀层、水相层和油层的成分，研究表明酶解作用增加了蛋白质的溶解性，油脂主要集中在油层和水相层，而且这些油脂中磷脂的含量比有机溶剂法提取的含量高。
周长平[10]用先添加中性蛋白酶再添加碱性蛋白酶的酶解方法得出虾油提取率为73.42%，其中不饱和脂肪酸含量达到 68.93%，明显高于有机溶剂提取的粗油（51.29%）；EPA和DHA的含量达到21.84%和 9.54%，也明显高于有机溶剂提取的粗油（EPA13.58%、DHA5.63%）。经过精炼后两种方法得到的虾油的脂肪酸含量趋于接近。
徐晓斌[11]以复合蛋白酶为工具酶，研究采用酶解法从南极磷虾中提取油脂，最佳酶解条件为：中性环境，酶用量0.13%，酶解温度43.8℃，酶解时间4.9h；在此条件下，南极磷虾油提取率为96.06%。
周长平等[12]采用酶解法结合溶剂萃取从南极磷虾中提取虾油，先加碱性蛋白酶酶解，再加入中性蛋白酶酶解，该法虾油的提取率为64.52%，提取的虾油酸值（KOH）为61.07mg/g，碘值（I）为157.87g/100g,过氧化值0.45mmol/kg,水分及挥发物0.84%，不皂化物0.64%，不溶性杂质0.09%，不饱和脂肪酸含量达到71.42%，其中EPA为9.82%，DHA为21.97%，具有很高的营养价值。
本研究在原有研究基础上主要探讨不同酶对虾油提取率的影响,寻找最佳酶，进而通过单因素试验讨论酶添加量、酶作用时间以及酶作用温度对虾油提取率的影响，最终通过响应曲面试验优化，得到最佳的实验条件，形成一套完整的、高效的、安全的虾油提取方法。
1 材料与方法
1．1 材料与试剂
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