土壤微生物来源的头孢类抗生素耐药基因筛选
目前被广泛使用的大多数抗生素都是由土壤微生物产生的，它们将抗生素作为武器彼此竞争生存所需的资源，而这些土壤菌群中必然有携带耐药基因用以保护自身或抵制危害。头孢类抗生素是β-内酰胺类抗生素中极为重要的一种，其对β-内酰胺酶的稳定性比青霉素类高、抗菌谱比青霉素类广、抗菌作用强、过敏反应少、毒性小，被世界临床医学广泛使用。然而，病原菌对它的耐药性却逐年上升，大大影响了其应用。本实验运用宏基因组学功能筛选的方法从土壤微生物中筛选头孢类耐药基因，并对其进行序列分析，旨在为临床医学、农业和畜牧业中细菌耐药性的预测和控制分析提供依据。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法2
1.1研究材料 2
1.2实验方法 3
1.2.1耐药阳性克隆的筛选3
1.2.2耐药亚克隆的构建3
1.2.3测序、分析及序列进化树的构建6
1.2.4最小抑菌浓度测定（MIC）6
2结果与分析7
2.1耐药阳性克隆的筛选7
2.2耐药亚克隆的构建7
2.3测序、分析及序列进化树的构建9
2.4最小抑菌浓度测定（MIC）10
3总结与讨论12
3.1总结12
3.2讨论12
致谢13
参考文献14
土壤微生物来源的头孢类抗生素耐药基因筛选
引言
引言
抗生素是20世纪最重要的医学发现之一。自四十年代被广泛使用以来，抗生素对控制人类及动物感染性疾病发挥了巨大的作用，据研究统计抗生素的发现和应用使人类的平均寿命延长了20年以上[1]，然而，随着抗菌药物的不断发展与应用，临床病原菌对常用抗菌药物的耐药性也不断发展。耐药菌的迅速传播严重地威胁着人类身体健康，细菌耐药问题也日益受到人们的重视，成为全球关注的热点[2]。β内酰胺类抗生素是一类含有典型的β内酰胺环结构的抗生素，它通过干扰敏感细菌细胞壁黏肽的合成，使细菌细胞壁缺损，菌体失去渗透保护屏障，导致细菌肿胀、变形，在自溶酶激活下，细菌破裂溶解而死 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
亡，主要包括四大类：头孢菌素类、青霉素类、青霉烯类和单环β内酰胺类抗生素[3]。β内酰胺类抗生素在临床上已广泛应用了数十年，在抗感染性疾病中发挥了极其重要的作用，然而随着在人医临床、畜牧业中的广泛应用乃至滥用，其耐药菌株相继涌现，已在全球范围内呈现爆发之势，极大地影响了此类抗生素的应用效果[4]。头孢类抗生素是β内酰胺类抗生素中极为重要的一类，由于其对β内酰胺酶的稳定性比青霉素类高、抗菌谱比青霉素类广、抗菌作用强、过敏反应少、毒性小[5]的特点，被世界临床医学广泛使用。因此如何快速准确的筛选出头孢类抗生素耐药基因并加以分析已成为如何解决日益增加的细菌抗药性研究的关键所在。
土壤中的微生物群落由很高的物种丰度和很复杂的群落组成[6]，据报道，平均每克森林土壤中含有约4×107个原核细胞，每克耕地或草地土壤含有约2×109个原核细胞[7]。这些原核生物由成千上万的微生物物种组成，为医药、工业应用及污染物的生物降解提供了宝贵的基因库[6]。然而自然界中目前能被纯培养的微生物还不到总数的1%，大量未被培养或不能被培养的微生物具有巨大的潜在利用价值。宏基因组学技术的出现成为了解决了以上难题的有效方法，宏基因组是指环境样品中所有生物遗传物质的总和。它避开了纯培养的难题，使得直接利用环境中丰富的微生物资源成为可能。通过宏基因组学功能筛选方法已成功发现了至少66种β内酰胺类抗生素耐药基因[8]，如2011年，Martiny等人[9]通过海鸥肠道微生物宏基因组学功能筛选，得到了31种尚未确定机制的新型β内酰胺抗性基因；2012年，Cheng. G等人[10]在人肠道微生物组中分离出了一种新的β内酰胺抗性基因；2014年Fiona. F等人[11]婴儿肠道微生物文库中也筛选得到β内酰胺抗性基因。这些研究都证明了宏基因组筛选方法在挖掘耐药基因研究中的可行性。
本课题利用实验室已构建的云南土壤宏基因组文库，应用功能筛选的方法从中筛选头孢类抗生素耐药基因，并通过序列测定及分析，探索其耐药机制。
1 材料与方法
1．1 研究材料
1．1．1 菌株来源
云南样品：取样于云南的土壤，共2560个编号，构建云南文库。
克隆宿主:大肠杆菌EPI100
1．1．2 试剂
培养基：
琼脂粉、琼脂粉购自北京寿德实验器材有限公司。
LB培养基(%)：
胰蛋白胨（BactoTryptone ）1.0，酵母浸粉（BactoYeast Extract）0.5，氯化钠（NaCl）1.0，Ph7.0；以上试剂购自上海生工生物有限公司。固体培养基加1%到2%琼脂粉。
MH培养基(%)：
MH肉汤粉 2.1，购自上海生工生物有限公司。固体培养基加1%到2%琼脂粉。
抗生素：
氨苄青霉素（Ampicillin）浓度为100mg/ml、氯霉素（Chloramphenicol）浓度为30mg/ml购自上海捷瑞生物有限公司，头孢他啶(Ceftazidime)纯度≥95%，购自SIGMA公司。
酶：
T4 DNA连接酶（Ligase）购自Thermo公司，限制性核酸内切酶（Sau3AⅠ）、限制性内切酶（BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ）、小牛肠碱性磷酸酶（CIAP）购自宝生物工程有限公司。
试剂盒：
质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京天根有限公司。
其他：克隆载体pTG19购自捷瑞生物有限公司、溴化乙锭、甘油、硼酸缓冲液（TBE）购自北京寿德实验器材有限公司。
1．1．2 设备
上海天美CT15RT高速冷冻离心机
Major Science金属浴
苏州苏洁SWCJ1FD超净工作台
太华全温度震荡培养箱
DNP9162电热恒温培养箱与烘箱
上海欧翔Gel X1520凝胶成像仪
上海民桥的SL2001N型电子天平
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法2
1.1研究材料 2
1.2实验方法 3
1.2.1耐药阳性克隆的筛选3
1.2.2耐药亚克隆的构建3
1.2.3测序、分析及序列进化树的构建6
1.2.4最小抑菌浓度测定（MIC）6
2结果与分析7
2.1耐药阳性克隆的筛选7
2.2耐药亚克隆的构建7
2.3测序、分析及序列进化树的构建9
2.4最小抑菌浓度测定（MIC）10
3总结与讨论12
3.1总结12
3.2讨论12
致谢13
参考文献14
土壤微生物来源的头孢类抗生素耐药基因筛选
引言
引言
抗生素是20世纪最重要的医学发现之一。自四十年代被广泛使用以来，抗生素对控制人类及动物感染性疾病发挥了巨大的作用，据研究统计抗生素的发现和应用使人类的平均寿命延长了20年以上[1]，然而，随着抗菌药物的不断发展与应用，临床病原菌对常用抗菌药物的耐药性也不断发展。耐药菌的迅速传播严重地威胁着人类身体健康，细菌耐药问题也日益受到人们的重视，成为全球关注的热点[2]。β内酰胺类抗生素是一类含有典型的β内酰胺环结构的抗生素，它通过干扰敏感细菌细胞壁黏肽的合成，使细菌细胞壁缺损，菌体失去渗透保护屏障，导致细菌肿胀、变形，在自溶酶激活下，细菌破裂溶解而死 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
亡，主要包括四大类：头孢菌素类、青霉素类、青霉烯类和单环β内酰胺类抗生素[3]。β内酰胺类抗生素在临床上已广泛应用了数十年，在抗感染性疾病中发挥了极其重要的作用，然而随着在人医临床、畜牧业中的广泛应用乃至滥用，其耐药菌株相继涌现，已在全球范围内呈现爆发之势，极大地影响了此类抗生素的应用效果[4]。头孢类抗生素是β内酰胺类抗生素中极为重要的一类，由于其对β内酰胺酶的稳定性比青霉素类高、抗菌谱比青霉素类广、抗菌作用强、过敏反应少、毒性小[5]的特点，被世界临床医学广泛使用。因此如何快速准确的筛选出头孢类抗生素耐药基因并加以分析已成为如何解决日益增加的细菌抗药性研究的关键所在。
土壤中的微生物群落由很高的物种丰度和很复杂的群落组成[6]，据报道，平均每克森林土壤中含有约4×107个原核细胞，每克耕地或草地土壤含有约2×109个原核细胞[7]。这些原核生物由成千上万的微生物物种组成，为医药、工业应用及污染物的生物降解提供了宝贵的基因库[6]。然而自然界中目前能被纯培养的微生物还不到总数的1%，大量未被培养或不能被培养的微生物具有巨大的潜在利用价值。宏基因组学技术的出现成为了解决了以上难题的有效方法，宏基因组是指环境样品中所有生物遗传物质的总和。它避开了纯培养的难题，使得直接利用环境中丰富的微生物资源成为可能。通过宏基因组学功能筛选方法已成功发现了至少66种β内酰胺类抗生素耐药基因[8]，如2011年，Martiny等人[9]通过海鸥肠道微生物宏基因组学功能筛选，得到了31种尚未确定机制的新型β内酰胺抗性基因；2012年，Cheng. G等人[10]在人肠道微生物组中分离出了一种新的β内酰胺抗性基因；2014年Fiona. F等人[11]婴儿肠道微生物文库中也筛选得到β内酰胺抗性基因。这些研究都证明了宏基因组筛选方法在挖掘耐药基因研究中的可行性。
本课题利用实验室已构建的云南土壤宏基因组文库，应用功能筛选的方法从中筛选头孢类抗生素耐药基因，并通过序列测定及分析，探索其耐药机制。
1 材料与方法
1．1 研究材料
1．1．1 菌株来源
云南样品：取样于云南的土壤，共2560个编号，构建云南文库。
克隆宿主:大肠杆菌EPI100
1．1．2 试剂
培养基：
琼脂粉、琼脂粉购自北京寿德实验器材有限公司。
LB培养基(%)：
胰蛋白胨（BactoTryptone ）1.0，酵母浸粉（BactoYeast Extract）0.5，氯化钠（NaCl）1.0，Ph7.0；以上试剂购自上海生工生物有限公司。固体培养基加1%到2%琼脂粉。
MH培养基(%)：
MH肉汤粉 2.1，购自上海生工生物有限公司。固体培养基加1%到2%琼脂粉。
抗生素：
氨苄青霉素（Ampicillin）浓度为100mg/ml、氯霉素（Chloramphenicol）浓度为30mg/ml购自上海捷瑞生物有限公司，头孢他啶(Ceftazidime)纯度≥95%，购自SIGMA公司。
酶：
T4 DNA连接酶（Ligase）购自Thermo公司，限制性核酸内切酶（Sau3AⅠ）、限制性内切酶（BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ）、小牛肠碱性磷酸酶（CIAP）购自宝生物工程有限公司。
试剂盒：
质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京天根有限公司。
其他：克隆载体pTG19购自捷瑞生物有限公司、溴化乙锭、甘油、硼酸缓冲液（TBE）购自北京寿德实验器材有限公司。
1．1．2 设备
上海天美CT15RT高速冷冻离心机
Major Science金属浴
苏州苏洁SWCJ1FD超净工作台
太华全温度震荡培养箱
DNP9162电热恒温培养箱与烘箱
上海欧翔Gel X1520凝胶成像仪
上海民桥的SL2001N型电子天平
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