电子鼻对假单胞菌生长状况的预测
电子鼻对假单胞菌生长状况的预测[20200509190322]
摘要：腐败微生物通常在新鲜肉的储存中造成大量损失，甚至会损害消费者的健康。开发实用性的电子鼻技术对由于微生物侵染造成的新鲜肉腐败进行检测，对特定的有害微生物不同生长过程中的变化和挥发性成分的分析是至关重要的。本文选择新鲜肉中的主要腐败微生物——假单胞菌作为研究对象。在3天的培养过程中，每12h（0h、12h、24h、36h、48h）通过电子鼻检测一次假单胞菌的气味，并且通过固相微萃取联合气质联用分析仪技术对假单胞菌的挥发性物质进行检测。结果表明：电子鼻不仅可以正确区分CK处理组与不同浓度假单胞菌的区别，还可以区分假单胞菌不同培养时间挥发物质的气味。气质实验结果表明假单胞菌的特征气味主要体现在硫化物和芳香类化合物。传感器响应值对假单胞菌的生长状况的模拟只有S8、S10可以建立较好的模型，而主成分中只有102铜绿假单胞菌处理组第一主成分和104铜绿假单胞菌处理组第二主成分可以建立较好的模型。本次试验将会为电子鼻对肉品储藏过程中由于微生物引起的肉品腐败的检测提供非常重要的信息。
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关键字:腐败微生物、电子鼻、气质联用、假单胞菌、生长模型
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Keywords 1
1 材料与方法 2
1.1腐败菌 2
1.2 试验仪器 2
1.3 试验方法 2
1.3.1实验处理 2
1.3.2 电子鼻 2
1.3.3固相微萃取结合气相色谱质谱联用 3
1.3.4血球计数板对不同浓度假单胞菌不同生长阶段的菌数进行计数 3
1.3.5数据分析 3
2 结果与分析 3
2.1传感器对铜绿假单胞菌挥发物的响应 3
2.2对电子鼻传感器的响应值进行多重比较 4
2.3载荷分析 5
2.4电子鼻对铜绿假单胞菌的区分 6
2.4.1铜绿假单胞菌不同生长阶段的电子鼻响应值的主成分分析 6
2.4.2不同浓度的铜绿假单胞菌电子鼻响应值主成分分析 7
2.5建立假单胞菌的生长模型 9
2.5.1通过传感器的响应值变化建立假单胞菌的生长模型 9
2.5.2假单胞菌的菌数生长模型 12
2.6固相微萃取联合气质联用法检测结果分析 13
3结论 14
致谢 14
参考文献 14
电子鼻对假单胞菌生长状况的预测
引言
在上个世纪关于肉品研究的发现和创新已经可以引起肉类生产、加工、销售和消费的革命性变化。近年来，肉类是最具有价值的畜产并且对很多人而言已经成为他们动物蛋白的第一选择来源[1]。但是，肉品由于丰富的营养成分，是微生物的天然培养基，在储存过程中极易受到腐败微生物的侵染，造成极大损失。其 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
中，假单胞菌就是引起肉品腐败的一种主要腐败菌[2]。
目前，对于微生物的检测方法主要是研究微生物形态的生理生化指标，但是需要大量的准备工作，耗时长，灵敏度也不高，而且对样品有一定的损伤，不能够及时地检测到腐败微生物。免疫学检测方法特异性好、灵敏度高，但实验前要对样品做比较繁琐且困难的处理工作。分子生物学方法主要针对核酸进行检测，与免疫学方法一样，特异性好、灵敏度高，但需要进行细胞破壁提取核酸[3]。这时，一种无损检测方法的出现就非常重要，电子鼻直接对假单胞菌的气味进行检测，来预测假单胞菌的生长状况，不需要对样品进行破坏处理[4-6]。目前，电子鼻已广泛应用于肉品质量评价、等级判定、成熟期判断、类别识别、生产过程检测与控制等方面。Rajamaki(2004)等用金属氧化物半导体传感器阵列，对气调包装猪肉的品质进行了分析和评价[7]。Hansen等人(2005)使用六个金属氧化物传感器组成的电子鼻在线分析肉制品加工中挥发性气体成分变化、评价肉品质量[8]。
本研究利用 PEN3 电子鼻获取不同浓度的假单胞菌的气味响应值，利用主成分分析确定基于电子鼻识别假单胞菌的可行性并通过载荷分析及气质联用确定区分假单胞菌的特征气体。
1 材料与方法
1.1腐败菌
选择肉品中常见的腐败菌：铜绿假单胞菌，铜绿假单胞菌来自实验室保藏菌种，置于营养琼脂斜面培养基上在4℃下保存。使用前，细菌接种到营养琼脂培养基上在37℃下活化培养3d之后，再次接种到营养琼脂培养基上进行二次培养2d，用生理盐水（0.9%NaCl）冲洗细菌，借助于血球计数板，调整至浓度为102和104cells/mL的菌液，备用。
1.2 试验仪器
德国AIRSENSE公司制造的便携式电子鼻（PEN3），美国安捷伦公司制造的气质联用仪（7890A/5975C），美国Supelco公司生产的固相微萃取装置（型号为65μm PDMS）。
1.3 试验方法
1.3.1实验处理
通过血球计数法，分别吸取浓度为1×102cells/mL和1×104cells/mL的假单胞菌悬浮液在直径为90mm的平板上涂布，37℃、90%相对湿度下进行培养，分别于培养0h、12h、24h、36h、48h后取出进行测量。每次试验设置三个处理组，分别为CK处理组、102铜绿假单胞菌处理组和104铜绿假单胞菌处理组，每个处理组设置20个样品。
图1 不同处理组培养0-48h的平板样品
1.3.2 电子鼻
假单胞菌的气味由便携式电子鼻（PEN 3, Win Muster Air-sense Analytics Inc., Germany）获得。电子鼻系统是由一个进样系统、一个包含10个金属氧化物传感器的探测系统和一个用于数据记录和分析的模式识别软件组成。每个传感器通常对不同的挥发性物质敏感。如表1：10个金属氧化物传感器分别为 W1C/S1（芳香型化合物）、W5S/S2（氮氧化物）、W3C/S3（氨类和芳香型化合物）、W6S/S4（氢气）、W5C/S5（烯烃和芳香型化合物）、W1S/S6（烃类物质）、W1W/S7（硫化氢）、W2S/S8（醇类和部分芳香型化合物）、W2W/S9（芳香化合物和有机硫化物）、W3S/S10（烷烃）[9]。
表1 10个金属氧化 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
物传感器的响应物质及灵敏度
传感器 响应物质 灵敏度
S1 对芳香型化合物敏感 10ppm
S2 对氮氧化物灵敏 NO2,1ppm
S3 对氨类、芳香型化合物敏感 苯,10ppm
S4 对氢气敏感 H2,100ppb
S5 对烃类、芳香型化合物等敏感 丙烷,1ppm
S6 环境中的甲烷敏感，具有较大的灵敏度 CH3,100ppm
S7 对硫化物、萜烯类物质有响应，对硫化氢特别敏感 H2S,1ppm
S8 对乙醇、部分芳香型化合物敏感度较大 CO,100ppm
S9 对芳香成分、有机硫化物敏感 H2S,1ppm
S10 主要对烃类物质有响应，对甲烷尤其敏感 CH3,100ppm
测定时进样针以恒定的速率吸取样品顶端空间的气体，气体进入传感器室后，10个传感器的导电率发生改变。传感器响应值即G/G0（相对电导率），G和G0分别代表样品气体的电导率和金属传感器吸附过滤后的空气的电导率。样品气体浓度越大，G/G0越偏离1，如果样品气体浓度低于检测限或者没有样品气体，则G/G0接近甚至等于[10,11]。
将铜绿假单胞菌的培养皿放置于1000mL的烧杯中，并用锡箔纸封口，于30℃下顶空30min便携式电子鼻（PEN3）进行测量，每隔12h测量一次，一直测到第48h。每次假单胞菌平板样品测定20个样，CK对照组测定10个样，共计30个样。试验参数：流速为300mL/min，测定时间为60s，洗气时间为110s，样品准备时间为5s，自动调零时间为5s。统计实验结果，发现传感器响应值在55s左右趋于平稳，所以选择59s处的传感器响应值用于数据分析。
1.3.3固相微萃取结合气相色谱质谱联用
假单胞菌的挥发性化合物由顶空固相微萃取结合气质联用进行收集和分析。每个样品取3个90mm的平板样品放置于500mL的烧杯中，并用锡箔纸封口，每次试验设置3个平行样与1个CK对照，于30℃下水浴。将PDMS萃取头插入进样口并推出纤维头进行老化，用老化过的萃取头在30℃下萃取30 min，然后将萃取头插入进样口进行测定，15min后取出萃取头，对下一个样品进行萃取[12]。试验参数设置：气相色谱仪进样口处温度为240 ℃，65um的PDMS萃取头于进样口解析3 min；柱温为50 ℃并保持5 min，然后以5℃/ min升至240 ℃，保持10 min；FID检测器温度为240 ℃；离子源温度为230 ℃；载气He的流速为1 mL/min；扫描范围为质荷比m/z 30-450。各组分经NIST谱库检索确定，相对含量以峰面积占检出气体总峰面积百分比表示。
摘要：腐败微生物通常在新鲜肉的储存中造成大量损失，甚至会损害消费者的健康。开发实用性的电子鼻技术对由于微生物侵染造成的新鲜肉腐败进行检测，对特定的有害微生物不同生长过程中的变化和挥发性成分的分析是至关重要的。本文选择新鲜肉中的主要腐败微生物——假单胞菌作为研究对象。在3天的培养过程中，每12h（0h、12h、24h、36h、48h）通过电子鼻检测一次假单胞菌的气味，并且通过固相微萃取联合气质联用分析仪技术对假单胞菌的挥发性物质进行检测。结果表明：电子鼻不仅可以正确区分CK处理组与不同浓度假单胞菌的区别，还可以区分假单胞菌不同培养时间挥发物质的气味。气质实验结果表明假单胞菌的特征气味主要体现在硫化物和芳香类化合物。传感器响应值对假单胞菌的生长状况的模拟只有S8、S10可以建立较好的模型，而主成分中只有102铜绿假单胞菌处理组第一主成分和104铜绿假单胞菌处理组第二主成分可以建立较好的模型。本次试验将会为电子鼻对肉品储藏过程中由于微生物引起的肉品腐败的检测提供非常重要的信息。
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目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Keywords 1
1 材料与方法 2
1.1腐败菌 2
1.2 试验仪器 2
1.3 试验方法 2
1.3.1实验处理 2
1.3.2 电子鼻 2
1.3.3固相微萃取结合气相色谱质谱联用 3
1.3.4血球计数板对不同浓度假单胞菌不同生长阶段的菌数进行计数 3
1.3.5数据分析 3
2 结果与分析 3
2.1传感器对铜绿假单胞菌挥发物的响应 3
2.2对电子鼻传感器的响应值进行多重比较 4
2.3载荷分析 5
2.4电子鼻对铜绿假单胞菌的区分 6
2.4.1铜绿假单胞菌不同生长阶段的电子鼻响应值的主成分分析 6
2.4.2不同浓度的铜绿假单胞菌电子鼻响应值主成分分析 7
2.5建立假单胞菌的生长模型 9
2.5.1通过传感器的响应值变化建立假单胞菌的生长模型 9
2.5.2假单胞菌的菌数生长模型 12
2.6固相微萃取联合气质联用法检测结果分析 13
3结论 14
致谢 14
参考文献 14
电子鼻对假单胞菌生长状况的预测
引言
在上个世纪关于肉品研究的发现和创新已经可以引起肉类生产、加工、销售和消费的革命性变化。近年来，肉类是最具有价值的畜产并且对很多人而言已经成为他们动物蛋白的第一选择来源[1]。但是，肉品由于丰富的营养成分，是微生物的天然培养基，在储存过程中极易受到腐败微生物的侵染，造成极大损失。其 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
中，假单胞菌就是引起肉品腐败的一种主要腐败菌[2]。
目前，对于微生物的检测方法主要是研究微生物形态的生理生化指标，但是需要大量的准备工作，耗时长，灵敏度也不高，而且对样品有一定的损伤，不能够及时地检测到腐败微生物。免疫学检测方法特异性好、灵敏度高，但实验前要对样品做比较繁琐且困难的处理工作。分子生物学方法主要针对核酸进行检测，与免疫学方法一样，特异性好、灵敏度高，但需要进行细胞破壁提取核酸[3]。这时，一种无损检测方法的出现就非常重要，电子鼻直接对假单胞菌的气味进行检测，来预测假单胞菌的生长状况，不需要对样品进行破坏处理[4-6]。目前，电子鼻已广泛应用于肉品质量评价、等级判定、成熟期判断、类别识别、生产过程检测与控制等方面。Rajamaki(2004)等用金属氧化物半导体传感器阵列，对气调包装猪肉的品质进行了分析和评价[7]。Hansen等人(2005)使用六个金属氧化物传感器组成的电子鼻在线分析肉制品加工中挥发性气体成分变化、评价肉品质量[8]。
本研究利用 PEN3 电子鼻获取不同浓度的假单胞菌的气味响应值，利用主成分分析确定基于电子鼻识别假单胞菌的可行性并通过载荷分析及气质联用确定区分假单胞菌的特征气体。
1 材料与方法
1.1腐败菌
选择肉品中常见的腐败菌：铜绿假单胞菌，铜绿假单胞菌来自实验室保藏菌种，置于营养琼脂斜面培养基上在4℃下保存。使用前，细菌接种到营养琼脂培养基上在37℃下活化培养3d之后，再次接种到营养琼脂培养基上进行二次培养2d，用生理盐水（0.9%NaCl）冲洗细菌，借助于血球计数板，调整至浓度为102和104cells/mL的菌液，备用。
1.2 试验仪器
德国AIRSENSE公司制造的便携式电子鼻（PEN3），美国安捷伦公司制造的气质联用仪（7890A/5975C），美国Supelco公司生产的固相微萃取装置（型号为65μm PDMS）。
1.3 试验方法
1.3.1实验处理
通过血球计数法，分别吸取浓度为1×102cells/mL和1×104cells/mL的假单胞菌悬浮液在直径为90mm的平板上涂布，37℃、90%相对湿度下进行培养，分别于培养0h、12h、24h、36h、48h后取出进行测量。每次试验设置三个处理组，分别为CK处理组、102铜绿假单胞菌处理组和104铜绿假单胞菌处理组，每个处理组设置20个样品。
图1 不同处理组培养0-48h的平板样品
1.3.2 电子鼻
假单胞菌的气味由便携式电子鼻（PEN 3, Win Muster Air-sense Analytics Inc., Germany）获得。电子鼻系统是由一个进样系统、一个包含10个金属氧化物传感器的探测系统和一个用于数据记录和分析的模式识别软件组成。每个传感器通常对不同的挥发性物质敏感。如表1：10个金属氧化物传感器分别为 W1C/S1（芳香型化合物）、W5S/S2（氮氧化物）、W3C/S3（氨类和芳香型化合物）、W6S/S4（氢气）、W5C/S5（烯烃和芳香型化合物）、W1S/S6（烃类物质）、W1W/S7（硫化氢）、W2S/S8（醇类和部分芳香型化合物）、W2W/S9（芳香化合物和有机硫化物）、W3S/S10（烷烃）[9]。
表1 10个金属氧化 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
物传感器的响应物质及灵敏度
传感器 响应物质 灵敏度
S1 对芳香型化合物敏感 10ppm
S2 对氮氧化物灵敏 NO2,1ppm
S3 对氨类、芳香型化合物敏感 苯,10ppm
S4 对氢气敏感 H2,100ppb
S5 对烃类、芳香型化合物等敏感 丙烷,1ppm
S6 环境中的甲烷敏感，具有较大的灵敏度 CH3,100ppm
S7 对硫化物、萜烯类物质有响应，对硫化氢特别敏感 H2S,1ppm
S8 对乙醇、部分芳香型化合物敏感度较大 CO,100ppm
S9 对芳香成分、有机硫化物敏感 H2S,1ppm
S10 主要对烃类物质有响应，对甲烷尤其敏感 CH3,100ppm
测定时进样针以恒定的速率吸取样品顶端空间的气体，气体进入传感器室后，10个传感器的导电率发生改变。传感器响应值即G/G0（相对电导率），G和G0分别代表样品气体的电导率和金属传感器吸附过滤后的空气的电导率。样品气体浓度越大，G/G0越偏离1，如果样品气体浓度低于检测限或者没有样品气体，则G/G0接近甚至等于[10,11]。
将铜绿假单胞菌的培养皿放置于1000mL的烧杯中，并用锡箔纸封口，于30℃下顶空30min便携式电子鼻（PEN3）进行测量，每隔12h测量一次，一直测到第48h。每次假单胞菌平板样品测定20个样，CK对照组测定10个样，共计30个样。试验参数：流速为300mL/min，测定时间为60s，洗气时间为110s，样品准备时间为5s，自动调零时间为5s。统计实验结果，发现传感器响应值在55s左右趋于平稳，所以选择59s处的传感器响应值用于数据分析。
1.3.3固相微萃取结合气相色谱质谱联用
假单胞菌的挥发性化合物由顶空固相微萃取结合气质联用进行收集和分析。每个样品取3个90mm的平板样品放置于500mL的烧杯中，并用锡箔纸封口，每次试验设置3个平行样与1个CK对照，于30℃下水浴。将PDMS萃取头插入进样口并推出纤维头进行老化，用老化过的萃取头在30℃下萃取30 min，然后将萃取头插入进样口进行测定，15min后取出萃取头，对下一个样品进行萃取[12]。试验参数设置：气相色谱仪进样口处温度为240 ℃，65um的PDMS萃取头于进样口解析3 min；柱温为50 ℃并保持5 min，然后以5℃/ min升至240 ℃，保持10 min；FID检测器温度为240 ℃；离子源温度为230 ℃；载气He的流速为1 mL/min；扫描范围为质荷比m/z 30-450。各组分经NIST谱库检索确定，相对含量以峰面积占检出气体总峰面积百分比表示。
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