土壤微生物来源的β内酰胺酶的异源表达与功能分析
抗生素的发现对人类和动物感染性疾病发挥了重要作用。然而近年来抗生素在人医临床、农业，尤其是畜牧业的滥用，导致了耐药菌的大范围爆发，如今已成为了一个严峻的全球性问题。作为抗生素主要生产菌和抗生素耐药基因根源的土壤微生物中蕴含了大量未知的耐药基因，在一定条件下它们能够在不同环境介质和微生物之间迁移和传播，因而对临床微生物和人类健康构成了极大的潜在威胁。本课题应用功能筛选方法从宏基因组文库中筛选头孢菌素类抗生素耐药基因，成功构建阳性亚克隆，并选取头孢他啶阳性亚克隆MQ-329、MQ-937，对功能基因进行异源表达，并初步验证了其耐药功能。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 菌株与载体2
1.1.2 主要仪器2
1.1.3 酶与生化试剂3
1.2 方法 3
1.2.1 抗生素配制3
1.2.2 培养基配制3
1.2.3 常用溶液的配制4
1.2.4 亚克隆构建4
1.2.5 引物的设计与合成4
1.2.6 功能基因的PCR扩增5
1.2.7 目的基因克隆载体重组质粒克隆产物的双酶切及回收6
1.2.8 构建重组蛋白表达载体6
1.2.9 β内酰胺酶基因的异源表达7
1.2.10 菌体裂解与β内酰胺酶的纯化7
1.2.11 β内酰胺酶的SDSPAGE凝胶检测7
1.2.12 β内酰胺酶的功能分析8
2 结果与分析10
2.1 功能基因的PCR扩增10
2.2 克隆子克隆产物的双酶切及回收10
2.3 β内酰胺酶基因的异源表达和纯化11
2.4 β内酰胺酶的功能分析11
2.4.1 体内反应11
2.4.2 体外反应12
3 讨论 12
3.1 诱导表达 12
3.2 目的蛋白的纯化与检测 12
3.3 目的蛋白 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
的功能分析 13
3.4 总结与展望 13
3.4.1 总结13
3.4.2 展望13
致谢13
参考文献13
土壤微生物来源的β内酰胺酶的异源表达与功能分析
引言
抗生素作为20世纪最重要的医学发现之一，对人类和动物感染性疾病的治疗和预防发挥了重要作用。然而近年来抗生素在人医临床及农业，特别是畜牧业中的滥用，导致了病原菌耐药性的大范围爆发。耐药菌的迅速传播严重威胁了人类健康，细菌耐药问题日渐被人们重视，成为了全球关注的热点[1]。这其中，β内酰胺类抗生素已广泛应用于人医临床数十年，作用巨大，然而耐药菌株的产生和传播极大地影响了其作用效果。对β内酰胺类抗生素耐药菌的流行性调查、耐药机理研究及耐药菌防控已成为该领域当前最为关注的焦点之一[2]。而上世纪90年代Pace等人[3]和Handelsman等人[4]提出的宏基因组学(metagenomics)，便成为了解决以上难题的有效方法。宏基因组学是以自然环境中的全部微小生物基因组为研究对象，通过提取某一特定环境中的所有微生物基因组DNA，构建宏基因组文库，从中寻找和发现新的功能基因的方法[5]。2004年Riesenfeld等人[6]首次报道了应用宏基因组学的方法来研究抗生素耐药基因，他们构建了6个土壤宏基因组文库，从中筛选出9个具有氨基糖苷类抗生素抗性的克隆子和1个具有四环素抗性的克隆子，除了一个抗性基因之外，其余所有抗性基因所编码的氨基酸序列都与已知序列差异较大(相似度<60%)。越来越多的报道证明土壤是一个巨大的抗性基因储备库，通过宏基因组学的方法可以发掘期中的未知抗性基因，能客观反映环境中抗性基因的多样性，为耐药菌耐药性防控的研究以及新型药物的研发提供新的思路。
β内酰胺类抗生素是一类含有典型β内酰胺环结构的抗生素，主要包括头孢菌素类、青霉素类、青霉烯类及单环β内酰胺类抗生素[7]。其抗菌机理为干扰细菌细胞壁黏肽的合成，使得细菌细胞壁缺损，菌体失去渗透保护屏障后而发生菌体肿胀、变形，最终在自溶酶的激活作用下，细菌发生破裂溶解而死亡。由于β内酰胺类抗生素抗菌谱广、对人类及动物安全、效果好、构效关系明确、可改造、工业水平高等优点，所以被大量开发应用。在今后相当一段时间内，仍是抗生素生产应用发展的主流[8]。该抗生素耐药机制主要包括：细菌产生的β内酰胺酶对抗生素的破坏导致耐药；细胞壁的屏障功能导致耐药；细菌内膜上PBPs的改变导致β内酰胺类抗生素不再能专一性地与其结合，而导致细菌产生耐药性等。其中，β内酰胺酶是目前研究最为深入的耐药机制之一。
随着宏基因组学的深入研究与发展，研究人员已在多种来源的宏基因组文库中发现了新型β内酰胺酶[9]。从遥远的阿拉斯加地区采集的土壤样品苏构建的宏基因组文库中，研究人员通过功能筛选的方法获得了13种新型β内酰胺酶，这13种新型β内酰胺酶包含了所有的四种Ambler类型，且经过比对，其与任何已知的功能基因的相似度都≤67％。此外，在该宏基因组文库中还发现了一个新型双功能β内酰胺酶基因。该基因编码了609个氨基酸，是典型β内酰胺酶长度的近两倍，且是两种不同的β内酰胺酶亚类基因的天然融合物。C端结构域（356个残基）与C类β内酰胺酶对齐，N端结构域（253个残基）却与D类β内酰胺酶对齐，每个都对全基因的抗性谱有贡献。C类同系物介导了头孢氨苄的抗性，D类同系物则介导对阿莫西林、氨苄青霉素以及羧苄青霉素的抗性。因此，双功能融合基因扩展了全长基因的抗性谱，超出了任一结构域单独作用的作用[10]。
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 菌株与载体2
1.1.2 主要仪器2
1.1.3 酶与生化试剂3
1.2 方法 3
1.2.1 抗生素配制3
1.2.2 培养基配制3
1.2.3 常用溶液的配制4
1.2.4 亚克隆构建4
1.2.5 引物的设计与合成4
1.2.6 功能基因的PCR扩增5
1.2.7 目的基因克隆载体重组质粒克隆产物的双酶切及回收6
1.2.8 构建重组蛋白表达载体6
1.2.9 β内酰胺酶基因的异源表达7
1.2.10 菌体裂解与β内酰胺酶的纯化7
1.2.11 β内酰胺酶的SDSPAGE凝胶检测7
1.2.12 β内酰胺酶的功能分析8
2 结果与分析10
2.1 功能基因的PCR扩增10
2.2 克隆子克隆产物的双酶切及回收10
2.3 β内酰胺酶基因的异源表达和纯化11
2.4 β内酰胺酶的功能分析11
2.4.1 体内反应11
2.4.2 体外反应12
3 讨论 12
3.1 诱导表达 12
3.2 目的蛋白的纯化与检测 12
3.3 目的蛋白 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
的功能分析 13
3.4 总结与展望 13
3.4.1 总结13
3.4.2 展望13
致谢13
参考文献13
土壤微生物来源的β内酰胺酶的异源表达与功能分析
引言
抗生素作为20世纪最重要的医学发现之一，对人类和动物感染性疾病的治疗和预防发挥了重要作用。然而近年来抗生素在人医临床及农业，特别是畜牧业中的滥用，导致了病原菌耐药性的大范围爆发。耐药菌的迅速传播严重威胁了人类健康，细菌耐药问题日渐被人们重视，成为了全球关注的热点[1]。这其中，β内酰胺类抗生素已广泛应用于人医临床数十年，作用巨大，然而耐药菌株的产生和传播极大地影响了其作用效果。对β内酰胺类抗生素耐药菌的流行性调查、耐药机理研究及耐药菌防控已成为该领域当前最为关注的焦点之一[2]。而上世纪90年代Pace等人[3]和Handelsman等人[4]提出的宏基因组学(metagenomics)，便成为了解决以上难题的有效方法。宏基因组学是以自然环境中的全部微小生物基因组为研究对象，通过提取某一特定环境中的所有微生物基因组DNA，构建宏基因组文库，从中寻找和发现新的功能基因的方法[5]。2004年Riesenfeld等人[6]首次报道了应用宏基因组学的方法来研究抗生素耐药基因，他们构建了6个土壤宏基因组文库，从中筛选出9个具有氨基糖苷类抗生素抗性的克隆子和1个具有四环素抗性的克隆子，除了一个抗性基因之外，其余所有抗性基因所编码的氨基酸序列都与已知序列差异较大(相似度<60%)。越来越多的报道证明土壤是一个巨大的抗性基因储备库，通过宏基因组学的方法可以发掘期中的未知抗性基因，能客观反映环境中抗性基因的多样性，为耐药菌耐药性防控的研究以及新型药物的研发提供新的思路。
β内酰胺类抗生素是一类含有典型β内酰胺环结构的抗生素，主要包括头孢菌素类、青霉素类、青霉烯类及单环β内酰胺类抗生素[7]。其抗菌机理为干扰细菌细胞壁黏肽的合成，使得细菌细胞壁缺损，菌体失去渗透保护屏障后而发生菌体肿胀、变形，最终在自溶酶的激活作用下，细菌发生破裂溶解而死亡。由于β内酰胺类抗生素抗菌谱广、对人类及动物安全、效果好、构效关系明确、可改造、工业水平高等优点，所以被大量开发应用。在今后相当一段时间内，仍是抗生素生产应用发展的主流[8]。该抗生素耐药机制主要包括：细菌产生的β内酰胺酶对抗生素的破坏导致耐药；细胞壁的屏障功能导致耐药；细菌内膜上PBPs的改变导致β内酰胺类抗生素不再能专一性地与其结合，而导致细菌产生耐药性等。其中，β内酰胺酶是目前研究最为深入的耐药机制之一。
随着宏基因组学的深入研究与发展，研究人员已在多种来源的宏基因组文库中发现了新型β内酰胺酶[9]。从遥远的阿拉斯加地区采集的土壤样品苏构建的宏基因组文库中，研究人员通过功能筛选的方法获得了13种新型β内酰胺酶，这13种新型β内酰胺酶包含了所有的四种Ambler类型，且经过比对，其与任何已知的功能基因的相似度都≤67％。此外，在该宏基因组文库中还发现了一个新型双功能β内酰胺酶基因。该基因编码了609个氨基酸，是典型β内酰胺酶长度的近两倍，且是两种不同的β内酰胺酶亚类基因的天然融合物。C端结构域（356个残基）与C类β内酰胺酶对齐，N端结构域（253个残基）却与D类β内酰胺酶对齐，每个都对全基因的抗性谱有贡献。C类同系物介导了头孢氨苄的抗性，D类同系物则介导对阿莫西林、氨苄青霉素以及羧苄青霉素的抗性。因此，双功能融合基因扩展了全长基因的抗性谱，超出了任一结构域单独作用的作用[10]。
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