大肠菌群的体外培养方法优化
摘要：大肠菌群对机体健康发挥着重要的作用，越来越多的研究证实，大肠菌群能将左旋肉碱代谢为三甲胺，三甲胺在肝脏被氧化为氧化三甲胺，从而诱发动脉粥样硬化。饮食是改变大肠菌群的一个很重要的因素，所以，或许饮食的改变可以延缓动脉粥样硬化的发展，本实验研究是否可以通过食物材料改变大肠菌群，使其处于健康的状态。我们建立了三甲胺和3，3-二甲基-1-丁醇的气相色谱—质谱定量检测方法，并以此设计实验来优化大肠菌群的体外培养方法，从而验证食物材料是否可以抑制左旋肉碱转化为三甲胺。基于检测结果，我们发现3，3-二甲基-1-丁醇存在于红酒等地中海饮食中，所以传统的地中海饮食对于延缓动脉粥样硬化的发展非常有益。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1□材料与方法2
1.1□材料 2
1.2□方法 3
1.2.1□TMA检测方法3
1.2.2□DMB检测方法3
1.2.3□胃肠道稳定性实验4
1.2.4□食物样品处理方法4
2□结果与分析4
2.1□TMA检测结果4
2.1.1□气相色谱—质谱图4
2.1.2□标准曲线5
2.2□DMB检测结果5
2.2.1□气相色谱—质谱图6
2.2.2□标准曲线7
2.3□胃肠道稳定性结果7
2.4□食物样品处理结果9
2.4.1□地中海饮食检测结果9
2.4.2□我国的传统发酵食物11
3□总结与讨论 12
致谢12
参考文献12
大肠菌群的体外培养方法优化
引言
心脑血管疾病是一种严重威胁人类，特别是中老年人健康的常见病，具有高患病率、高致残率和高死亡率的特点。众所周知，心脑血管疾病的发生和日常饮食密切相关。卵磷脂的代谢产物—胆碱、氧化三甲胺、甜菜碱与心脑血管疾病相关，能早期预测心脑血管疾病的发生，其中氧化三甲胺的生成依赖于大肠菌群。大肠菌群参与卵磷脂的代谢加快动脉粥样硬化。大肠菌群通过对卵磷脂中的胆碱
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
部分在碳氮键位置切割产生三甲胺，三甲胺为一种能在体内扩散的气体，在肝脏中经黄素单加氧酶催化生成氧化三甲胺，氧化三甲胺介导动脉粥样硬化。另一种含三甲胺的营养物左旋肉碱，富含在红肉（如牛肉、羊肉）中同样通过大肠菌群的切割产生三甲胺进一步氧化为氧化三甲胺而促进小鼠动脉粥样硬化。
三甲胺类营养物在饮食中普遍存在，所有三甲胺类营养物都有可能通过大肠菌群的切割生成三甲胺进而氧化成氧化三甲胺而导致动脉粥样硬化。因此如何抑制大肠菌群对三甲胺类营养物的切割将成为一个有效地减轻动脉粥样硬化的治疗方案。
如果能够对肠道内微生物进行干预，或可预防动脉硬化。在研究中，研究人员给小鼠长期服用左旋肉碱，令其体内肠道微生物成分发生改变，导致血液中三甲胺N氧化物（trimethylamine—N—oxide，TMAO）升高，并发生动脉硬化。然后，研究人员筛选出抑制TMAO的化合物3，3二甲基丁醇（3，3dimethyl—1—butanol，DMB），并给小鼠提供这样的食物，最终发现DMB可以显著降低小鼠体内TMAO的水平，抑制动脉斑块形成，并且没有毒副作用。进一步研究还表明，DMB确实能够通过抑制三甲胺的形成来起作用。而且DMB不杀死大肠菌群，只是降低与高水平三甲胺、TMAO和动脉硬化有关的特定细菌在大肠菌群中所占的比例。
图1 大肠菌群代谢L肉碱或胆碱示意图
大肠菌群通过三甲胺裂解酶催化含三甲胺官能团化合物在碳氮键位置裂解。胆碱化学结构类似物3，3二甲基1丁醇（DMB）对胆碱三甲胺裂解酶有抑制效应。DMB对多种含三甲胺官能团的化合物被三甲胺裂解酶的裂解显示抑制效应，因此DMB为一种广谱三甲胺类抑制剂，通过抑制多种三甲胺类营养物在肠道中经细菌的切割，降低血中氧化三甲胺的浓度，从而降低动脉粥样硬化。DMB还能改变肠道中细菌的组成，通过降低具有三甲胺裂解酶活性的细菌组成而成为降低血中氧化三甲胺的浓度、治疗动脉粥样硬化的又一途径。
而在地中海式饮食中可能含有DMB。研究人员因此认为，地中海式饮食通过改变肠道细菌的活性来发挥健康效应。通过膳食补充一种在地中海饮食中含量丰富的DMB，可防止小鼠肠道细菌将不健康食品转化为堵塞动脉的代谢副产品。
本实验花费了大量时间摸索TMA和DMB的气相色谱—质谱定量检测方法，最后得到了用于定量检测TMA 和DMB的标准曲线，这对于食物材料的检测至关重要。本实验想验证是否可以通过食物材料改变大肠菌群，使其处于健康的状态，并以此设计实验来优化大肠菌群的体外培养方法，从而验证食物材料是否可以抑制左旋肉碱转化为三甲胺。基于检测结果，我们发现3，3二甲基1丁醇存在于以红酒和橄榄油为代表的地中海饮食中，所以传统的地中海饮食对于延缓动脉粥样硬化的发展非常有益。
1 材料与方法
1．1 材料
试剂：TMA标样，DMB标样，胃蛋白酶，胰脂肪酶，PH7的PBS磷酸缓冲液，正己烷（色谱纯），以上试剂均购自西格玛奥德里奇公司；食物材料：张裕解百纳干红葡萄酒，张裕赤霞珠干红葡萄酒，Agrioil SpA (Italy)特级压榨橄榄油，山西老陈醋，镇江香醋，海天酱油生抽，海天酱油老抽，以上食物材料购自苏果超市；仪器：Agilent 7890 / 5975C气相色谱—质谱联用仪 (GC/MS)，手动顶空固相微萃取(solid phase microextraction，SPME) 进样器，65μm 聚二甲基硅氧烷/二乙烯苯(polydimethylsiloxane/divinylbenzene，PDMS/DVB)涂层萃取头（美国 Supelco 公司），顶空瓶。
1．2 方法
本实验基于TMA和DMB不同的理化性质，选择了不同的气相色谱—质谱定量检测方法。为证明DMB是否可以稳定存在于胃肠道环境中，进行了体外模拟胃肠液的实验。同时，基于我们建立的DMB测定方法，我们对地中海饮食中常见的红酒、橄榄油等食物材料进行了分析测定，证实红酒和橄榄油中存在DMB后，又做了加标回收实验，还对我国的传统发酵食物，如醋，酱油等进行了分析测定。
1．2．1 TMA检测方法 三甲胺英文名称为trimethylamine(TMA) , 是最简单的叔胺，分子式(CH3)3N , 其无水物为无色液化气体。有鱼腥的氨气味，是挥发性的气体物质。能溶于水、乙醇和乙醚。易燃烧，自燃点 190℃。相对密度 0.632(20/4℃)，相对分子质量为59.11，CAS号为75503。
TMA是易挥发的物质，基于其理化性质，我们采用了顶空固相微萃取的检测方法。具体参数及升温程序如下：
气相色谱条件：采用HP5MS色谱柱； 载气(He)流速为 0.3mL/min； 不分流模式进样，恒压 35kPa； 进样口温度为 270℃ ； 接口温度为 210℃。程序升温：柱温 35℃， 保持 2min，以 3℃ /min 上升至40℃，保持 1min，再以 30℃ /min 上升至 200℃， 保持7min。质谱条件：电子轰击离子源；电子能量 70eV；离子源温度 200℃ ；质量扫描范围为 45～1000u。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1□材料与方法2
1.1□材料 2
1.2□方法 3
1.2.1□TMA检测方法3
1.2.2□DMB检测方法3
1.2.3□胃肠道稳定性实验4
1.2.4□食物样品处理方法4
2□结果与分析4
2.1□TMA检测结果4
2.1.1□气相色谱—质谱图4
2.1.2□标准曲线5
2.2□DMB检测结果5
2.2.1□气相色谱—质谱图6
2.2.2□标准曲线7
2.3□胃肠道稳定性结果7
2.4□食物样品处理结果9
2.4.1□地中海饮食检测结果9
2.4.2□我国的传统发酵食物11
3□总结与讨论 12
致谢12
参考文献12
大肠菌群的体外培养方法优化
引言
心脑血管疾病是一种严重威胁人类，特别是中老年人健康的常见病，具有高患病率、高致残率和高死亡率的特点。众所周知，心脑血管疾病的发生和日常饮食密切相关。卵磷脂的代谢产物—胆碱、氧化三甲胺、甜菜碱与心脑血管疾病相关，能早期预测心脑血管疾病的发生，其中氧化三甲胺的生成依赖于大肠菌群。大肠菌群参与卵磷脂的代谢加快动脉粥样硬化。大肠菌群通过对卵磷脂中的胆碱
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
部分在碳氮键位置切割产生三甲胺，三甲胺为一种能在体内扩散的气体，在肝脏中经黄素单加氧酶催化生成氧化三甲胺，氧化三甲胺介导动脉粥样硬化。另一种含三甲胺的营养物左旋肉碱，富含在红肉（如牛肉、羊肉）中同样通过大肠菌群的切割产生三甲胺进一步氧化为氧化三甲胺而促进小鼠动脉粥样硬化。
三甲胺类营养物在饮食中普遍存在，所有三甲胺类营养物都有可能通过大肠菌群的切割生成三甲胺进而氧化成氧化三甲胺而导致动脉粥样硬化。因此如何抑制大肠菌群对三甲胺类营养物的切割将成为一个有效地减轻动脉粥样硬化的治疗方案。
如果能够对肠道内微生物进行干预，或可预防动脉硬化。在研究中，研究人员给小鼠长期服用左旋肉碱，令其体内肠道微生物成分发生改变，导致血液中三甲胺N氧化物（trimethylamine—N—oxide，TMAO）升高，并发生动脉硬化。然后，研究人员筛选出抑制TMAO的化合物3，3二甲基丁醇（3，3dimethyl—1—butanol，DMB），并给小鼠提供这样的食物，最终发现DMB可以显著降低小鼠体内TMAO的水平，抑制动脉斑块形成，并且没有毒副作用。进一步研究还表明，DMB确实能够通过抑制三甲胺的形成来起作用。而且DMB不杀死大肠菌群，只是降低与高水平三甲胺、TMAO和动脉硬化有关的特定细菌在大肠菌群中所占的比例。
图1 大肠菌群代谢L肉碱或胆碱示意图
大肠菌群通过三甲胺裂解酶催化含三甲胺官能团化合物在碳氮键位置裂解。胆碱化学结构类似物3，3二甲基1丁醇（DMB）对胆碱三甲胺裂解酶有抑制效应。DMB对多种含三甲胺官能团的化合物被三甲胺裂解酶的裂解显示抑制效应，因此DMB为一种广谱三甲胺类抑制剂，通过抑制多种三甲胺类营养物在肠道中经细菌的切割，降低血中氧化三甲胺的浓度，从而降低动脉粥样硬化。DMB还能改变肠道中细菌的组成，通过降低具有三甲胺裂解酶活性的细菌组成而成为降低血中氧化三甲胺的浓度、治疗动脉粥样硬化的又一途径。
而在地中海式饮食中可能含有DMB。研究人员因此认为，地中海式饮食通过改变肠道细菌的活性来发挥健康效应。通过膳食补充一种在地中海饮食中含量丰富的DMB，可防止小鼠肠道细菌将不健康食品转化为堵塞动脉的代谢副产品。
本实验花费了大量时间摸索TMA和DMB的气相色谱—质谱定量检测方法，最后得到了用于定量检测TMA 和DMB的标准曲线，这对于食物材料的检测至关重要。本实验想验证是否可以通过食物材料改变大肠菌群，使其处于健康的状态，并以此设计实验来优化大肠菌群的体外培养方法，从而验证食物材料是否可以抑制左旋肉碱转化为三甲胺。基于检测结果，我们发现3，3二甲基1丁醇存在于以红酒和橄榄油为代表的地中海饮食中，所以传统的地中海饮食对于延缓动脉粥样硬化的发展非常有益。
1 材料与方法
1．1 材料
试剂：TMA标样，DMB标样，胃蛋白酶，胰脂肪酶，PH7的PBS磷酸缓冲液，正己烷（色谱纯），以上试剂均购自西格玛奥德里奇公司；食物材料：张裕解百纳干红葡萄酒，张裕赤霞珠干红葡萄酒，Agrioil SpA (Italy)特级压榨橄榄油，山西老陈醋，镇江香醋，海天酱油生抽，海天酱油老抽，以上食物材料购自苏果超市；仪器：Agilent 7890 / 5975C气相色谱—质谱联用仪 (GC/MS)，手动顶空固相微萃取(solid phase microextraction，SPME) 进样器，65μm 聚二甲基硅氧烷/二乙烯苯(polydimethylsiloxane/divinylbenzene，PDMS/DVB)涂层萃取头（美国 Supelco 公司），顶空瓶。
1．2 方法
本实验基于TMA和DMB不同的理化性质，选择了不同的气相色谱—质谱定量检测方法。为证明DMB是否可以稳定存在于胃肠道环境中，进行了体外模拟胃肠液的实验。同时，基于我们建立的DMB测定方法，我们对地中海饮食中常见的红酒、橄榄油等食物材料进行了分析测定，证实红酒和橄榄油中存在DMB后，又做了加标回收实验，还对我国的传统发酵食物，如醋，酱油等进行了分析测定。
1．2．1 TMA检测方法 三甲胺英文名称为trimethylamine(TMA) , 是最简单的叔胺，分子式(CH3)3N , 其无水物为无色液化气体。有鱼腥的氨气味，是挥发性的气体物质。能溶于水、乙醇和乙醚。易燃烧，自燃点 190℃。相对密度 0.632(20/4℃)，相对分子质量为59.11，CAS号为75503。
TMA是易挥发的物质，基于其理化性质，我们采用了顶空固相微萃取的检测方法。具体参数及升温程序如下：
气相色谱条件：采用HP5MS色谱柱； 载气(He)流速为 0.3mL/min； 不分流模式进样，恒压 35kPa； 进样口温度为 270℃ ； 接口温度为 210℃。程序升温：柱温 35℃， 保持 2min，以 3℃ /min 上升至40℃，保持 1min，再以 30℃ /min 上升至 200℃， 保持7min。质谱条件：电子轰击离子源；电子能量 70eV；离子源温度 200℃ ；质量扫描范围为 45～1000u。
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