施用芽孢杆菌生物有机肥后黄瓜根际细菌生物膜形成能力协同效应研究
解淀粉芽孢杆菌SQR9是本实验室从黄瓜种植发病区的健康植株根际分离的一株根际促生菌，在盆栽和大田试验中表现出显著的促生和生防效果。本实验通过生长曲线测定、生物膜形成能力比较和游动实验等，研究了施用SQR9制成的生物有机肥后黄瓜根际细菌对芽孢杆菌SQR9的协同作用。共筛选出11株细菌，并与SQR9进行生物膜共培养，从中挑选了3株能促进SQR9生物膜形成的菌株进行了生长曲线的测定和游动能力比较。通过16SrDNA鉴定，PZ5为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis），PZ43为酸快生芽孢杆菌（Bacillus acidiceler），PZ24为不可培养的细菌（Uncultured bacterium）。将3株菌株分别与SQR9进行混合培养，发现PZ5和PZ43号在12h到24h之间能够明显促进SQR9的生长，PZ24与SQR9能产生良好的协同作用。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 实验材料 2
1.1.2 培养基及试剂 2
1.2 方法 2
1.2.1 黄瓜根茎土壤协同菌的筛选 2
1.2.2 生物膜形成效果验证 2
1.2.3 菌体总DNA的提取 2
1.2.4 菌株16S rDNA的PCR扩增 2
1.2.5 PCR产物的T/A克隆、转化和测序3
1.2.6菌株系统发育地位的确定3
1.2.7 菌株生长曲线的测定 3
1.2.8 游动试验 3
2 结果与分析3
2.1 黄瓜根茎土壤协同菌的筛选与鉴定 3
2.2 生物膜形成效果验证 6
2.3 菌株系统发育地位的确定 9
2.4 筛选菌株与SQR9共同培养的生长曲线 14
2.5 游动试验结果 15
3 讨论 17
致谢17
参考文献17
施用芽孢杆菌生物有机肥后黄瓜根际细菌生物膜形成能力协同效应研究 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
引言
引言
根据统计，我国的经济作物种植面积已超5亿亩/年，占将近总耕地面积的30%。这样的高效率、集约化的农业生产模式有效的提高了农业产量和农民的收入，但同时也带来了严重的土壤问题。近年来，植物根际促生菌（PGPR）因其具有显著的促进植物生长或防控土传病害的能力以及环境友好、安全无毒的特点，在农业生产上得到越来越广泛的应用。例如在经济作物（黄瓜、西瓜、马铃薯、香蕉、甜瓜、烟草、棉花等）上施用由含有PGPR菌株的生物有机肥料后，不同外源有益菌在根际土壤中的数量均可达到106/克土以上，比土体土壤高出2个以上的数量级[14]，这种根际和根表微生物的局部调控主要来自PGPR与根系分泌物的互作结果[5]。PGPR在根际的有效定殖，能显著促进根际养分的转化，防御土传病原菌的侵入。由此可见，有效地施用PGPR菌株是减少我国农用化学品投入的重要途径之一。
目前，限制生物肥料应用的主要瓶颈之一是其田间应用效果的稳定性较差。由于对生物肥料作用机理了解不深，肥料中的微生物菌株在复杂根际环境中的竞争定殖机制缺乏系统研究，从而对田间效果稳定性差的成因分析不准，也无法提出有效的解决途径。本实验尝试在施用生物有机肥后的黄瓜根际土壤中筛选出可以促进SQR9生物膜形成和根际定殖的菌株，这些菌株很有可能在根际原位帮助SQR9发挥生防作用，深入了解这些菌株和SQR9的协作关系，能为更好地发挥PGPR在农业生产上的应用提供理论依据。
材料与方法
1．1 实验材料、培养基及试剂
1．1．1 实验材料 供试菌株：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）SQR9和大肠杆菌Top10由大学资源与环境学院植物营养系分离并保存。分离拮抗菌的土壤样品，采自江苏省资源节约型肥料工程研究中心温室甜瓜根际土壤。供试甜瓜品种为津春4号。
1．1．2 培养基及试剂
LuriaBertani培养基：Peptone 10g，Yeast Extract 5g，H2O 1000 ml。
MSNc培养基：Potassium phosphate buffer 5 mM pH 7.0，MOPS 100 mM pH 7.0，MgCl2 2 mM，CaCl2 700 mM，MnCl2 50 mM，ZnCl2 1 μM，Thiamine 2 μM，0.2% NH4Cl，0.5% Cellobiose[6]。
Bmedium：15 mM (NH4)2SO4，4 mM MgSO4 7H20，27 mM KCl，7 mM Na3C6H5O7 2H2O，50 mM TrisHCl pH 7.5，2 mM CaCl，1 μM FeSO4 7H20，10 μM MnSO4 4H20，0.6 mM KH2PO3，4.5 mM Monosodium glutamate，0.86 mM Lysine，0.78 mM Tryptophan，2% Glutamine。
1．2 实验方法
1．2．1 黄瓜根茎土壤协同菌的筛选 采用土壤稀释分离法：称取黄瓜根茎土土样5克，置于45 ml黄瓜根茎土土壤悬液中，剧烈震荡后，稀释至102～107，取105～107用于目标细菌的筛选[7]。
1．2．2 生物膜形成效果验证 生物膜的测定方法参照Hamon和Lazazzera[8]，稍作修改。将过夜活化的协同菌单菌落和SQR9种于新鲜LB液体培养基中，37℃，170 r min1培养至OD600约为1.0。离心收集菌体，用无菌水反复轻轻吹吸混匀后重悬于等体积的MSNc培养基中。生物膜定性试验采用24孔细胞培养板，在培养孔中加入2 mlMSNc培养基，然后分别在培养孔中接入SQR9、筛选菌各10 μl，SQR9:3 μl筛选菌:7 μl，筛选菌：3 μl，SQR9：7 μl ,于37℃静置培养，观察SQR9和协同菌以及混合培养的成膜情况。
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 实验材料 2
1.1.2 培养基及试剂 2
1.2 方法 2
1.2.1 黄瓜根茎土壤协同菌的筛选 2
1.2.2 生物膜形成效果验证 2
1.2.3 菌体总DNA的提取 2
1.2.4 菌株16S rDNA的PCR扩增 2
1.2.5 PCR产物的T/A克隆、转化和测序3
1.2.6菌株系统发育地位的确定3
1.2.7 菌株生长曲线的测定 3
1.2.8 游动试验 3
2 结果与分析3
2.1 黄瓜根茎土壤协同菌的筛选与鉴定 3
2.2 生物膜形成效果验证 6
2.3 菌株系统发育地位的确定 9
2.4 筛选菌株与SQR9共同培养的生长曲线 14
2.5 游动试验结果 15
3 讨论 17
致谢17
参考文献17
施用芽孢杆菌生物有机肥后黄瓜根际细菌生物膜形成能力协同效应研究 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
引言
引言
根据统计，我国的经济作物种植面积已超5亿亩/年，占将近总耕地面积的30%。这样的高效率、集约化的农业生产模式有效的提高了农业产量和农民的收入，但同时也带来了严重的土壤问题。近年来，植物根际促生菌（PGPR）因其具有显著的促进植物生长或防控土传病害的能力以及环境友好、安全无毒的特点，在农业生产上得到越来越广泛的应用。例如在经济作物（黄瓜、西瓜、马铃薯、香蕉、甜瓜、烟草、棉花等）上施用由含有PGPR菌株的生物有机肥料后，不同外源有益菌在根际土壤中的数量均可达到106/克土以上，比土体土壤高出2个以上的数量级[14]，这种根际和根表微生物的局部调控主要来自PGPR与根系分泌物的互作结果[5]。PGPR在根际的有效定殖，能显著促进根际养分的转化，防御土传病原菌的侵入。由此可见，有效地施用PGPR菌株是减少我国农用化学品投入的重要途径之一。
目前，限制生物肥料应用的主要瓶颈之一是其田间应用效果的稳定性较差。由于对生物肥料作用机理了解不深，肥料中的微生物菌株在复杂根际环境中的竞争定殖机制缺乏系统研究，从而对田间效果稳定性差的成因分析不准，也无法提出有效的解决途径。本实验尝试在施用生物有机肥后的黄瓜根际土壤中筛选出可以促进SQR9生物膜形成和根际定殖的菌株，这些菌株很有可能在根际原位帮助SQR9发挥生防作用，深入了解这些菌株和SQR9的协作关系，能为更好地发挥PGPR在农业生产上的应用提供理论依据。
材料与方法
1．1 实验材料、培养基及试剂
1．1．1 实验材料 供试菌株：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）SQR9和大肠杆菌Top10由大学资源与环境学院植物营养系分离并保存。分离拮抗菌的土壤样品，采自江苏省资源节约型肥料工程研究中心温室甜瓜根际土壤。供试甜瓜品种为津春4号。
1．1．2 培养基及试剂
LuriaBertani培养基：Peptone 10g，Yeast Extract 5g，H2O 1000 ml。
MSNc培养基：Potassium phosphate buffer 5 mM pH 7.0，MOPS 100 mM pH 7.0，MgCl2 2 mM，CaCl2 700 mM，MnCl2 50 mM，ZnCl2 1 μM，Thiamine 2 μM，0.2% NH4Cl，0.5% Cellobiose[6]。
Bmedium：15 mM (NH4)2SO4，4 mM MgSO4 7H20，27 mM KCl，7 mM Na3C6H5O7 2H2O，50 mM TrisHCl pH 7.5，2 mM CaCl，1 μM FeSO4 7H20，10 μM MnSO4 4H20，0.6 mM KH2PO3，4.5 mM Monosodium glutamate，0.86 mM Lysine，0.78 mM Tryptophan，2% Glutamine。
1．2 实验方法
1．2．1 黄瓜根茎土壤协同菌的筛选 采用土壤稀释分离法：称取黄瓜根茎土土样5克，置于45 ml黄瓜根茎土土壤悬液中，剧烈震荡后，稀释至102～107，取105～107用于目标细菌的筛选[7]。
1．2．2 生物膜形成效果验证 生物膜的测定方法参照Hamon和Lazazzera[8]，稍作修改。将过夜活化的协同菌单菌落和SQR9种于新鲜LB液体培养基中，37℃，170 r min1培养至OD600约为1.0。离心收集菌体，用无菌水反复轻轻吹吸混匀后重悬于等体积的MSNc培养基中。生物膜定性试验采用24孔细胞培养板，在培养孔中加入2 mlMSNc培养基，然后分别在培养孔中接入SQR9、筛选菌各10 μl，SQR9:3 μl筛选菌:7 μl，筛选菌：3 μl，SQR9：7 μl ,于37℃静置培养，观察SQR9和协同菌以及混合培养的成膜情况。
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