硝酸还原酶产生的no对不同氮素利用率水稻根系生长的影响
摘要： 1关键词 1Abstract： 1Key words: 2引言 21 材料与方法 31．1 试验材料 31．2 样本处理 31．2．1 种子发苗 31．2．2 样本差异处理 31．3 测量侧根密度和测量侧根原基数量 41. 4 根系NO测量方法 42 结果分析 42．1 全铵供氮和PNN处理根系生长状况以及NO浓度测定结果 42．1．1 侧根生长状况 42．1．2 根系NO荧光检测结果 52．1．3 根系密度与NO在侧根和根尖区域的荧光检测 52．2 外源NO供体SNP、NO消除剂cPTIO以及硝酸还原酶抑制剂Tu处理数据 62. 2. 1 不同处理根系NO荧光反应检测及侧根密度 62. 2. 2 侧根原基数量 73 结论 74 讨论 8致谢 10参考文献： 10硝酸还原酶产生的NO对不同氮素利用率水稻根系生长的影响摘要：水稻根系有发达的通气组织，能够通过泌氧作用将根表或根际的铵态氮转化成硝态氮，使水稻根系处于铵硝混合营养中。因此硝酸盐也是水稻重要的氮素营养成分，而且低浓度的NO3-还可以促进水稻根系尤其是侧根生长。越来越多的证据显示铵硝混合可提高植物生长和提高水稻的氮素利用效率。而NO（一氧化氮）是涉及许多植物生长过程中的生理学过程，包括氮同化过程的信号分子。但是PNN（铵硝混合）处理产生的NO是如何提升NUE（氮素利用率）的机理并不十分清楚。本论文以两个对NO3-营养响应度差异明显的水稻品种南光(强响应)和Elio(弱响应)为研究对象。采用水培和琼脂培养方法研究了在全NH4+（NH4+/NO3-=100/0）和铵硝混合营养（PNN，NH4+/NO3-=75/25）条件下不同品种的水稻NO的积累、硝酸还原酶活性和侧根密度等指标。PNN提高南光NO的累积水平很可能是通过硝酸还原酶亚硝酸还原酶途径。研究表明，PNN供应显著增加了南光品种的NO水平，并对其根毛和侧根的密度有显著影响，而硝响应弱的Elio则没有明显差异。而且进一步研究表明，经过特殊诱导和标记，与单独供应NH4+相比，供应NH4++SNP（硝普钠）的两种水稻根系的生长和发生更加活跃，实验处理过程中使用cPTIO或者Tu（硝酸还原酶抑制剂）以防止铵态氮还原生成NO。上述实验结果与水稻根系NO荧光检测的结果一致。本次实验研究结果证明了硝酸还原酶途径产生的NO通过刺激根系发
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生进一步增加了水稻根系氮吸收能力。研究结果有可能解释水稻对不同氮素形态的响应机理并进一步提高氮肥利用率。
目录
引言
引言
氮素营养影响植物的各种生理功能，包括新陈代谢、养分分配、生长发育[12]。植物可以通过调节其养分吸收能力和通过改变其新陈代谢和形态特征来适应巨大的氮素养分供应波动，如改变其根系形态[34]。在模式植物拟南芥中已经证明了外源硝酸盐对其根系生长产生的双重影响：（1）局部硝供应可以刺激侧根的伸长；（2）高浓度硝抑制侧根原基的伸长[5]。许多涉及microRNAs、转录因子、荷尔蒙信号以及硝酸盐载体的过程与氮素和植物激素的关系密切。然而我们对植物如和识别外部硝酸盐状况以及其识别的信号转导系统是如何运作的仍了解有限，这对根系的生长和植物养分摄取能力有重要意义。
一氧化氮作为一个信号分子物质在植物发育和养分积累过程中参与到了许多生理过程。有许多证据表明NO与植物根系的生长发育有关[67]。CorreaAragunde et?al.认为生长素和NO在土豆的侧根形成过程中起到直接传导信号的作用。事实上土豆根系中NO抑制NR的活性可能取决于硝酸盐积累[8]。
在植物中，一氧化氮合成酶和硝酸还原酶是一氧化氮合成的两条重要途径[9]。不过在动物体内使用NOS抑制剂的实验也为证明L精氨酸途径在NO生成过程起的作用提供了一些证据。NR途径是植物体内比较重要的NO来源，生根培养基中硝酸盐的积累可以通过调节NR活性来影响NO的量[10]。拟南芥和蚕豆的研究实验证明了硝酸盐和亚硝酸盐的绝对含量是NR催化产生NO的关键决定因子[11]。NO是一种由NR途径产生的与硝酸盐有关的信号物质，可调节根系结构。但是NO在硝酸盐信号调控过程中的具体作用还需做进一步探究。
水稻(Oryza sativa L.)是一种在世界范围内都很重要的主要粮食作物，通常在淹水条件下种植。铵态氮（NH4+）与硝态氮（NO3）相比，水稻更喜欢铵态氮。在铵硝混合状态下水稻的生长与其根系的硝化作用有关。许多研究结果表明PNN可以促进水稻生长，提高起N吸收和同化作用，对后生根的形成和侧根的发育也有影响[1213]。两种水稻品种南光和Eilo的选用，是20032004年通过田间试验从177个水稻品种中筛选出来的，主要根据它们相似的生长模式以及对氮的不同响应情况来筛选的。最初根据对增硝的响应不同，选出了7个氮高效品种和3个氮低效品种，在水培条件下进行深入的研究之后发现，7个品种中有5个在增硝营养条件下具有较高的氮利用效率，而3个品种对增硝营养具有较低的氮利用效率在溶液培养的条件下五株氮高效利用率的水稻对PNN敏感，3株氮低效的水稻对PNN并不敏感。我们假设NO在提高NUE中起关键作用是一种对硝酸盐的进化适应机制。
（1）PNN处理与单一的NH4+处理相比，在高效氮肥利用率的植株中对硝酸盐的积累是有诱导作用的，但在低NUE株系中则没有这种现象[14]。
（2）PNN对生长素的积极诱导作用，对高效氮利用率的植株的后生根和侧根的生长的影响[15]。
生长素与NO在信号转导过程中起到相同的作用，诱导植株产生生长素并且催生不定根和侧根[16]。在本次实验设计中，我们的主要目的是为了探究PNN处理下以硝酸盐反应和氮素利用率为对照的两组水稻对NO的反应，及其对水稻侧根生长发育影响。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验所用两种水稻分别为对硝酸盐营养强响应的cvs南光以及对硝酸盐营养弱响应的Elio。南光是一种高硝酸盐应答并且有较高的NUE的水稻品种，而Elio正好相反。选择材料的依据是2003~2004年4个试验点的大田试验结果的筛选，其基本性状见表21(张亚丽等, 2004)。
两种水稻品种（cvs南光和Elio），它们是从177株日本晴中根据其在相同的田间实验条件下对N供应产生不同的反应而挑选出来的。
1.2 样本处理
1.2.1 种子发苗
南光和Elio种子经30%NaClO3消毒30 min，蒸馏水润洗表面，洗去NaClO3溶液，在温室中受自然光照，发苗生长，昼夜温度分别为30°C和18°C。发苗七天后将其移苗至带盖周转箱，要求幼苗形态活力基本一致。每个周转箱盖有4个孔洞，每个空洞移栽3株幼苗。转入水培箱供应四分之一营养液和半营养液各两天，而后供应全营养14天。
1.2.2 样本处理
完成发苗步骤后，对两种不同样本进行实验处理，幼苗供应的氮素（铵硝比例）分为两种比例，一种NH4+N/NO3N比例为100/0，一种比例为75/25。通过供应1.43毫摩尔的 (NH4)2SO4 或者混合供应(NH4)2SO4 和 NH4NO3。其它营养元素比例根据国际水稻研究所（IRRI） 规定的水稻营养液配方：大量元素（mM）：0.3 KH2PO4；0.35 K2SO4；1.0 CaCl2；1.0 MgSO47H2O； 0.5 Na2SiO3；微量元素(μM)： 20.0 FeEDTA；9.0 MnCl2； 0.39 (NH4)6Mo7O24；20.0 H3BO3；0.77 ZnSO4； and 0.32 CuSO4; 营养液最终pH调节到 5.5左右，偏差在0.1以内。
为了抑制营养液中的铵态氮氧化，每一个水培箱都加入硝化抑制剂（双氰胺，7.0μM）。水培箱的营养液每天定时更换，这样单独供应NH4+的培养液中就不会产生硝酸盐。处理十四天后收获。每个处理按随机设计原则做4个平行处理以避免边缘效应。此外，所有的实验包括三个独立的生物学重复。
采用药理学手段进行控制条件下的水培和Agar试验，研究了外源不同浓度NO供体SNP、NO的清除剂cPTIO以及硝酸还原酶活性抑制剂钨酸钠对水稻种子根上侧根发生的影响以及水稻内源NO的浓度变化。比如，在cv.南光用浓度为1或2.5μM SNP处理的单独供应铵态氮的处理产生的侧根密度和PNN处理的侧根密度水平基本一致。但是，而在Elio中供应≥ 5 μM SNP浓度才能达到与PNN处理侧根密度相同的水平。Tu作为一种硝酸还原酶抑制剂对两种水稻品种的抑制效果也是有差异的，在南光中，PNN处理组供应浓度为50μM的Tu时其侧根密度水平基本与单独供应铵态氮组一致，而Elio要达到这种效果则需要浓度为100μM的Tu。因此，在进行后续实验过程中，南光和Elio采用不同的SNP和Tu浓度。SNP浓度：南光2.5 μM ，Elio 5μM；Tu浓度： 南光50 μM，Elio 100μM。
外源药品施加以下几种：010μM 硝普钠（SNP）、80μM 24羧苯基四甲基咪唑烷1氧3氧化物（cPTIO）和钨酸钠（Tugstate）（其中南光施加50μM，Eilo施加100μM）。
1.3 测量侧根密度和侧根原基数量
研究表明，PNN促进了cv.南光的后生根和侧根的生成(Song et al., 2011b)。在短期实验中（14天）侧根的形成明显增加，而不定根的形成则未受影响[17]。因此侧根的密度和原基细胞的数量被选作下一步的具体实验分析。
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生进一步增加了水稻根系氮吸收能力。研究结果有可能解释水稻对不同氮素形态的响应机理并进一步提高氮肥利用率。
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引言
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氮素营养影响植物的各种生理功能，包括新陈代谢、养分分配、生长发育[12]。植物可以通过调节其养分吸收能力和通过改变其新陈代谢和形态特征来适应巨大的氮素养分供应波动，如改变其根系形态[34]。在模式植物拟南芥中已经证明了外源硝酸盐对其根系生长产生的双重影响：（1）局部硝供应可以刺激侧根的伸长；（2）高浓度硝抑制侧根原基的伸长[5]。许多涉及microRNAs、转录因子、荷尔蒙信号以及硝酸盐载体的过程与氮素和植物激素的关系密切。然而我们对植物如和识别外部硝酸盐状况以及其识别的信号转导系统是如何运作的仍了解有限，这对根系的生长和植物养分摄取能力有重要意义。
一氧化氮作为一个信号分子物质在植物发育和养分积累过程中参与到了许多生理过程。有许多证据表明NO与植物根系的生长发育有关[67]。CorreaAragunde et?al.认为生长素和NO在土豆的侧根形成过程中起到直接传导信号的作用。事实上土豆根系中NO抑制NR的活性可能取决于硝酸盐积累[8]。
在植物中，一氧化氮合成酶和硝酸还原酶是一氧化氮合成的两条重要途径[9]。不过在动物体内使用NOS抑制剂的实验也为证明L精氨酸途径在NO生成过程起的作用提供了一些证据。NR途径是植物体内比较重要的NO来源，生根培养基中硝酸盐的积累可以通过调节NR活性来影响NO的量[10]。拟南芥和蚕豆的研究实验证明了硝酸盐和亚硝酸盐的绝对含量是NR催化产生NO的关键决定因子[11]。NO是一种由NR途径产生的与硝酸盐有关的信号物质，可调节根系结构。但是NO在硝酸盐信号调控过程中的具体作用还需做进一步探究。
水稻(Oryza sativa L.)是一种在世界范围内都很重要的主要粮食作物，通常在淹水条件下种植。铵态氮（NH4+）与硝态氮（NO3）相比，水稻更喜欢铵态氮。在铵硝混合状态下水稻的生长与其根系的硝化作用有关。许多研究结果表明PNN可以促进水稻生长，提高起N吸收和同化作用，对后生根的形成和侧根的发育也有影响[1213]。两种水稻品种南光和Eilo的选用，是20032004年通过田间试验从177个水稻品种中筛选出来的，主要根据它们相似的生长模式以及对氮的不同响应情况来筛选的。最初根据对增硝的响应不同，选出了7个氮高效品种和3个氮低效品种，在水培条件下进行深入的研究之后发现，7个品种中有5个在增硝营养条件下具有较高的氮利用效率，而3个品种对增硝营养具有较低的氮利用效率在溶液培养的条件下五株氮高效利用率的水稻对PNN敏感，3株氮低效的水稻对PNN并不敏感。我们假设NO在提高NUE中起关键作用是一种对硝酸盐的进化适应机制。
（1）PNN处理与单一的NH4+处理相比，在高效氮肥利用率的植株中对硝酸盐的积累是有诱导作用的，但在低NUE株系中则没有这种现象[14]。
（2）PNN对生长素的积极诱导作用，对高效氮利用率的植株的后生根和侧根的生长的影响[15]。
生长素与NO在信号转导过程中起到相同的作用，诱导植株产生生长素并且催生不定根和侧根[16]。在本次实验设计中，我们的主要目的是为了探究PNN处理下以硝酸盐反应和氮素利用率为对照的两组水稻对NO的反应，及其对水稻侧根生长发育影响。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验所用两种水稻分别为对硝酸盐营养强响应的cvs南光以及对硝酸盐营养弱响应的Elio。南光是一种高硝酸盐应答并且有较高的NUE的水稻品种，而Elio正好相反。选择材料的依据是2003~2004年4个试验点的大田试验结果的筛选，其基本性状见表21(张亚丽等, 2004)。
两种水稻品种（cvs南光和Elio），它们是从177株日本晴中根据其在相同的田间实验条件下对N供应产生不同的反应而挑选出来的。
1.2 样本处理
1.2.1 种子发苗
南光和Elio种子经30%NaClO3消毒30 min，蒸馏水润洗表面，洗去NaClO3溶液，在温室中受自然光照，发苗生长，昼夜温度分别为30°C和18°C。发苗七天后将其移苗至带盖周转箱，要求幼苗形态活力基本一致。每个周转箱盖有4个孔洞，每个空洞移栽3株幼苗。转入水培箱供应四分之一营养液和半营养液各两天，而后供应全营养14天。
1.2.2 样本处理
完成发苗步骤后，对两种不同样本进行实验处理，幼苗供应的氮素（铵硝比例）分为两种比例，一种NH4+N/NO3N比例为100/0，一种比例为75/25。通过供应1.43毫摩尔的 (NH4)2SO4 或者混合供应(NH4)2SO4 和 NH4NO3。其它营养元素比例根据国际水稻研究所（IRRI） 规定的水稻营养液配方：大量元素（mM）：0.3 KH2PO4；0.35 K2SO4；1.0 CaCl2；1.0 MgSO47H2O； 0.5 Na2SiO3；微量元素(μM)： 20.0 FeEDTA；9.0 MnCl2； 0.39 (NH4)6Mo7O24；20.0 H3BO3；0.77 ZnSO4； and 0.32 CuSO4; 营养液最终pH调节到 5.5左右，偏差在0.1以内。
为了抑制营养液中的铵态氮氧化，每一个水培箱都加入硝化抑制剂（双氰胺，7.0μM）。水培箱的营养液每天定时更换，这样单独供应NH4+的培养液中就不会产生硝酸盐。处理十四天后收获。每个处理按随机设计原则做4个平行处理以避免边缘效应。此外，所有的实验包括三个独立的生物学重复。
采用药理学手段进行控制条件下的水培和Agar试验，研究了外源不同浓度NO供体SNP、NO的清除剂cPTIO以及硝酸还原酶活性抑制剂钨酸钠对水稻种子根上侧根发生的影响以及水稻内源NO的浓度变化。比如，在cv.南光用浓度为1或2.5μM SNP处理的单独供应铵态氮的处理产生的侧根密度和PNN处理的侧根密度水平基本一致。但是，而在Elio中供应≥ 5 μM SNP浓度才能达到与PNN处理侧根密度相同的水平。Tu作为一种硝酸还原酶抑制剂对两种水稻品种的抑制效果也是有差异的，在南光中，PNN处理组供应浓度为50μM的Tu时其侧根密度水平基本与单独供应铵态氮组一致，而Elio要达到这种效果则需要浓度为100μM的Tu。因此，在进行后续实验过程中，南光和Elio采用不同的SNP和Tu浓度。SNP浓度：南光2.5 μM ，Elio 5μM；Tu浓度： 南光50 μM，Elio 100μM。
外源药品施加以下几种：010μM 硝普钠（SNP）、80μM 24羧苯基四甲基咪唑烷1氧3氧化物（cPTIO）和钨酸钠（Tugstate）（其中南光施加50μM，Eilo施加100μM）。
1.3 测量侧根密度和侧根原基数量
研究表明，PNN促进了cv.南光的后生根和侧根的生成(Song et al., 2011b)。在短期实验中（14天）侧根的形成明显增加，而不定根的形成则未受影响[17]。因此侧根的密度和原基细胞的数量被选作下一步的具体实验分析。
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