稻田土壤有机砷去甲基化微生物qy1的分离筛选鉴定及其去甲基化分子机制的初步研究
摘要：稻田中有机砷MAs(III)的去甲基化过程是稻田砷循环转化过程的重要组成部分，但是介导这一过程的微生物尚未被发现。本研究从一份砷污染的稻田土壤中分离筛选到了一株具有 MAs(III)去甲基化能力的微生物QY-1，该菌株不仅可以将MAs(III)转化成As(III)，还具有矿化MAs(V)的能力。通过全基因组测序，我们鉴定分析了菌株QY-1中MAs(III)去甲基化的基因(QYarsI)。我们利用酵母菌株表达序列优化的QYarsI，定性检测了转基因酵母的抗MAs(III)的能力，但是结果显示转基因酵母菌对Mas(III)的抗性并没有加强。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Keywords3
引言3
1材料与方法4
1.1实验材料4
1.2实验方法4
1.2.1菌株筛选过程4
1.2.2 菌株QY1的分类学鉴定5
1.2.3鉴定及优化MAs(III)去甲基化基因5
1.2.4转aesI基因酵母的构建5
2.结果分析7
2.1 MAs(III)去甲基化细菌的分离筛选7
2.2 QY1的分类鉴定8
2. 3 arsI 基因的鉴定和优化. 9
2.4 酵母转化实验结果10
3.讨论11
致谢12
参考文献13
稻田土壤有机砷去甲基化微生物QY1的分离筛选、鉴定及其去甲基化分子机制的初步研究
环境工程学生 苏聪斌
引言
砷(As)位于元素周期表第V主族，原子序数33，是一种剧毒的类金属元素，广泛分布于各种水体和土壤中。美国的环境保护署将其列为有毒有害物质表(http://www.atsdr.cdc.gov/SPL/index.html)的首位。砷污染已经成为一个全球性的环境问题。砷的污染主要来源于两个方面：1、自然来源包括岩石中伴生的砷，是影响全球砷循环的主要动力，它直接决定了土壤、大气和生物体内砷的含量和分布；2、人为的因素人类生产和生活中排放的砷，例如：采矿(Z
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hu et al.,2008.)、含砷农药的使用(Wiliams et al.,2007.)以及高含砷量地下水进行农业灌溉(Su et al,.2010)等很大程度上造成部分地区中土壤砷含量超标。水稻是人类主要的粮食作物之 一,然而,目前稻米主要生产区(东南亚地区)的土壤和灌溉水砷污染严重,导致稻米中砷的积累。砷在稻米中的积累通过食物链传递,对人体健康构成严重威胁。 所以，稻米砷污染问题已成为东南亚地区比较突出且急需解决的环境问题之一。稻田中砷的形态可以分为无机砷和有机砷两大类(Jia et al,.2012)。在一定的条件下，土壤中的砷能够在微生物的作用下进行形态的转化(Islam.et al.2004;陈同斌.1996)，会有单甲基砷(MMA)、二甲基砷（DMA）和三甲基砷(TMA)的产生(杨婧等，2009)。无机砷[As(Ⅲ)和As(V)]可以通过微生物的甲基化作用转化为毒性较低的有机砷化合物，例如五价单甲基砷MAs(V)、五价二甲基砷DMAs(V)、五价三甲基砷氧化物TMAs(V)O等。除了微生物的砷甲基化作用，有机砷类化合物还可能来自于含砷杀虫剂和除草剂的使用。另外，稻田土壤中的，有机砷类化合物也可逆向转化为无机砷化合物，这一逆向过程称为有机砷的去甲基化过程，砷的微生物甲基化和去甲基化过程是砷地球化学循环的重要组成部分。这一逆向过程称为有机砷的去甲基化过程。
目前为止已发现的具有有机砷去甲基化能力的微生物比较少，仅有几例：从有机砷污染的高尔夫球场土壤中分离的两株具有有机砷转化能力的微生物Burkholderia sp.MR1 和Streptomyces sp.MD1，前者可以将MAs(V)还原为MAs(Ⅲ)而后者会利用前者的转化产物，将其进一步去甲基化生成As(III) ；并在佛罗里达的高尔夫球场土壤出分离出一株具有MAs(III)去甲基化能力的微生物Bacillus sp. MD1，并从中克隆了MAs(III)的去甲基化基因arsI。(Masafumi Yoshinaga and Barry P. Rosen, 2014)
稻田中同样也发现了上述类似的有机砷矿化过程，并且也有研究报道在该过程中微生物起到了非常重要的作用。然而，到目前为止，研究人员并未能从稻田中分离鉴定到这些相关微生物，本研究从稻田土壤中分离到了一株具有 MAs(III) 去甲基化能力的微生物QY1，并对其为什么具有这种能力的分子机制进行初步的阐释，并试图为后续进一步构建转基因的功能植物奠定了先期理论基础。
1材料与方法
1.1供试土壤、试剂、质粒、菌株和培养基：供试土壤:采自郴州、祁阳典型砷污染水稻土2份，风干后过10目筛，放在阴暗处备用，后续准备用于土壤培养实验。实验所用的化学试剂均为分析纯的。实验所用的质粒和菌株如下：质粒pET29a(+)和pYES2.0，大肠杆菌DH 5α和野生型酵母菌株INVSc1。实验所用的培养基为：SDUra培养基，ST101培养基[蛋白胨 0.5 gl1,酵母粉 0.05gl1，0.5% （g/V）葡萄糖],LB培养基（蛋白胨 10g,酵母粉5g,氯化钠 10g）。
1.2实验方法
1.2.1菌株的筛选过程：
富集培养：将郴州、祁阳水稻土各2g放入两个三角瓶中（ST101 培养基），加入5μL MAs(III)，在转速200 rpm，30℃的摇床中培养4天后，利用HPLCICPMS来检测培养基中砷的形态，从而验证富集液是否有MAs(III)去甲基化的能力。
稀释涂布：事先准备好ST101固体培养基、无菌水和灭好菌的1.5ml离心管，每个离心管里面加入900ul的无菌水，然后取100ul的富集液加入到离心管中，混匀，梯度稀释（101~108）到ST101固体培养基上。30℃培养箱培养3 ~5天后，挑取形态明显有区分的单菌落，挑取过程如下：平板上生长出的MAs(III)抗性细菌然后用10ul的白色枪头挑起菌落置于5ml含MAs(III)的ST101培养基试管中，30℃摇床培养3~5天。
功能验证：待菌液浑浊以后取出，吸取1ml菌液离心，取上清，放入装有MAs(III)浓度为1μM的ST101培养液的离心管中，利用HPLCICPMS来检测砷的形态，验证该试管中原菌是否有对MAs(III)去甲基化作用。
菌种保存：将第四步的菌液进一步纯化，用烧红的接种环蘸取菌液在ST101培养基上进行划线，封好平板于30培养箱培养3 ~5天。如果最后平板上长出来的全部是单菌落，则挑取菌落到含LB培养基的试管于30℃摇床培养进行生长，待浑浊后吸取500 ul的菌液到1.5 ml的离心管，加入30%的甘油500ul，混匀后贴好标签保存于80℃冰箱。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Keywords3
引言3
1材料与方法4
1.1实验材料4
1.2实验方法4
1.2.1菌株筛选过程4
1.2.2 菌株QY1的分类学鉴定5
1.2.3鉴定及优化MAs(III)去甲基化基因5
1.2.4转aesI基因酵母的构建5
2.结果分析7
2.1 MAs(III)去甲基化细菌的分离筛选7
2.2 QY1的分类鉴定8
2. 3 arsI 基因的鉴定和优化. 9
2.4 酵母转化实验结果10
3.讨论11
致谢12
参考文献13
稻田土壤有机砷去甲基化微生物QY1的分离筛选、鉴定及其去甲基化分子机制的初步研究
环境工程学生 苏聪斌
引言
砷(As)位于元素周期表第V主族，原子序数33，是一种剧毒的类金属元素，广泛分布于各种水体和土壤中。美国的环境保护署将其列为有毒有害物质表(http://www.atsdr.cdc.gov/SPL/index.html)的首位。砷污染已经成为一个全球性的环境问题。砷的污染主要来源于两个方面：1、自然来源包括岩石中伴生的砷，是影响全球砷循环的主要动力，它直接决定了土壤、大气和生物体内砷的含量和分布；2、人为的因素人类生产和生活中排放的砷，例如：采矿(Z
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
hu et al.,2008.)、含砷农药的使用(Wiliams et al.,2007.)以及高含砷量地下水进行农业灌溉(Su et al,.2010)等很大程度上造成部分地区中土壤砷含量超标。水稻是人类主要的粮食作物之 一,然而,目前稻米主要生产区(东南亚地区)的土壤和灌溉水砷污染严重,导致稻米中砷的积累。砷在稻米中的积累通过食物链传递,对人体健康构成严重威胁。 所以，稻米砷污染问题已成为东南亚地区比较突出且急需解决的环境问题之一。稻田中砷的形态可以分为无机砷和有机砷两大类(Jia et al,.2012)。在一定的条件下，土壤中的砷能够在微生物的作用下进行形态的转化(Islam.et al.2004;陈同斌.1996)，会有单甲基砷(MMA)、二甲基砷（DMA）和三甲基砷(TMA)的产生(杨婧等，2009)。无机砷[As(Ⅲ)和As(V)]可以通过微生物的甲基化作用转化为毒性较低的有机砷化合物，例如五价单甲基砷MAs(V)、五价二甲基砷DMAs(V)、五价三甲基砷氧化物TMAs(V)O等。除了微生物的砷甲基化作用，有机砷类化合物还可能来自于含砷杀虫剂和除草剂的使用。另外，稻田土壤中的，有机砷类化合物也可逆向转化为无机砷化合物，这一逆向过程称为有机砷的去甲基化过程，砷的微生物甲基化和去甲基化过程是砷地球化学循环的重要组成部分。这一逆向过程称为有机砷的去甲基化过程。
目前为止已发现的具有有机砷去甲基化能力的微生物比较少，仅有几例：从有机砷污染的高尔夫球场土壤中分离的两株具有有机砷转化能力的微生物Burkholderia sp.MR1 和Streptomyces sp.MD1，前者可以将MAs(V)还原为MAs(Ⅲ)而后者会利用前者的转化产物，将其进一步去甲基化生成As(III) ；并在佛罗里达的高尔夫球场土壤出分离出一株具有MAs(III)去甲基化能力的微生物Bacillus sp. MD1，并从中克隆了MAs(III)的去甲基化基因arsI。(Masafumi Yoshinaga and Barry P. Rosen, 2014)
稻田中同样也发现了上述类似的有机砷矿化过程，并且也有研究报道在该过程中微生物起到了非常重要的作用。然而，到目前为止，研究人员并未能从稻田中分离鉴定到这些相关微生物，本研究从稻田土壤中分离到了一株具有 MAs(III) 去甲基化能力的微生物QY1，并对其为什么具有这种能力的分子机制进行初步的阐释，并试图为后续进一步构建转基因的功能植物奠定了先期理论基础。
1材料与方法
1.1供试土壤、试剂、质粒、菌株和培养基：供试土壤:采自郴州、祁阳典型砷污染水稻土2份，风干后过10目筛，放在阴暗处备用，后续准备用于土壤培养实验。实验所用的化学试剂均为分析纯的。实验所用的质粒和菌株如下：质粒pET29a(+)和pYES2.0，大肠杆菌DH 5α和野生型酵母菌株INVSc1。实验所用的培养基为：SDUra培养基，ST101培养基[蛋白胨 0.5 gl1,酵母粉 0.05gl1，0.5% （g/V）葡萄糖],LB培养基（蛋白胨 10g,酵母粉5g,氯化钠 10g）。
1.2实验方法
1.2.1菌株的筛选过程：
富集培养：将郴州、祁阳水稻土各2g放入两个三角瓶中（ST101 培养基），加入5μL MAs(III)，在转速200 rpm，30℃的摇床中培养4天后，利用HPLCICPMS来检测培养基中砷的形态，从而验证富集液是否有MAs(III)去甲基化的能力。
稀释涂布：事先准备好ST101固体培养基、无菌水和灭好菌的1.5ml离心管，每个离心管里面加入900ul的无菌水，然后取100ul的富集液加入到离心管中，混匀，梯度稀释（101~108）到ST101固体培养基上。30℃培养箱培养3 ~5天后，挑取形态明显有区分的单菌落，挑取过程如下：平板上生长出的MAs(III)抗性细菌然后用10ul的白色枪头挑起菌落置于5ml含MAs(III)的ST101培养基试管中，30℃摇床培养3~5天。
功能验证：待菌液浑浊以后取出，吸取1ml菌液离心，取上清，放入装有MAs(III)浓度为1μM的ST101培养液的离心管中，利用HPLCICPMS来检测砷的形态，验证该试管中原菌是否有对MAs(III)去甲基化作用。
菌种保存：将第四步的菌液进一步纯化，用烧红的接种环蘸取菌液在ST101培养基上进行划线，封好平板于30培养箱培养3 ~5天。如果最后平板上长出来的全部是单菌落，则挑取菌落到含LB培养基的试管于30℃摇床培养进行生长，待浑浊后吸取500 ul的菌液到1.5 ml的离心管，加入30%的甘油500ul，混匀后贴好标签保存于80℃冰箱。
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