一株菲降解细菌的分离筛选及其成膜能力和降解特性研究
摘要：本研究采用富集培养法，从多环芳烃(PAHs)污染区的健康植物看麦娘(Alopecurus aequalis Sobol)根表分离筛选出1株能以菲为唯一碳源和能源进行生长的成膜细菌PHE-2，150 r·min-1、30℃摇床培养72 h后，该菌对菲的降解率高达99.3%。通过生理生化特征分析16S rRNA基因序列同源性分析，该菌为类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)细菌。菌株PHE-2的生长及其对菲的降解对环境有较强的适应能力。当温度为30~45℃，pH为7.0~9.0时，培养3 d，菌株PHE-2良好生长，对菲的降解率均高达90%以上。当底物浓度为10~100mg·L-1时，菌株PHE-2对菲的降解率为99%以上，且其可以在较高的底物浓度(200 mg·L-1)下以菲为唯一碳源生长并降解菲。此外，菌株PHE-2对氨苄青霉素有较强抗性（100mg·L-1)，对低浓度的壮观霉素(10~20 mg·L-1)、链霉素(10 mg·L-1)有一定抗性。同时，菌株PHE-2具有较强的成膜能力，具备在根表形成生物膜的潜质。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1材料与方法 2
1.1试验材料 2
1.2培养基 2
1.3具有菲降解功能的植物根表功能细菌的分离筛选 2
1.4植物根表功能细菌的菌悬液制备 3
1.5降解菌株的菌种鉴定 3
1.5.1菌体总DNA的提取 3
1.5.2菌株 16S rRNA 基因的 PCR 扩增 3
1.6根表功能细菌对菲的降解特性 3
1.6.1菌株生长和菲降解率的测定 3
1.6.2环境条件对菌株生长和菲降解的影响 3
1.7根表功能细菌的生物学特性 3
1.7.1抗性试验 3
1.7.2菌株成膜能力检测 3
2结果与分析 4
2.1根表功能细菌的鉴定 4
2.1.1菌株PHE2的形态特征 4
2.1.2菌株 16SrRNA 基因序列同源性分析 4
r /> 2.2菲降解根表功能细菌的生长和降解曲线 4
2.3环境条件对菌株生长和菲降解的影响 5
2.3.1温度影响 5
2.3.2 pH影响 6
2.3.3接种量影响 6
2.3.4底物浓度影响 7
2.4抗性实验 7
2.5菌株成膜能力 8
3结论 8
致谢 9
参考文献 9
一株菲降解细菌的分离筛选及其成膜能力和降解特性研究
引言
引言
持久性有机污染物（Persistent Organic Pollutants，POPs）因其具有环境持久性、生物积累性、长距离迁移能力和高生物毒性而对全球环境和人类健康有着巨大威胁。而多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是一类在环境中稳定存在且分布广泛的有机污染物，在POPs中有着重要的地位。PAHs在我国的污染主要体现于被石油污染的大气、土壤和水体中。土壤PAHs污染相比大气污染和水体污染而言，具有长期性、隐蔽性、不可逆性以及不能完全被分解或消逝的特点，因此危害严重、治理困难。找寻有效的办法解决土壤PAHs污染问题越来越受到世界各国的重视[1]。土壤PAHs污染修复技术主要有物理修复、化学修复和微生物修复等，而微生物修复技术由于对环境的影响小，同时能够高效的降低污染物浓度，现已被广泛使用。因此，土壤PAHs高效降解菌的筛选分离是实现PAHs污染土壤微生物修复的关键之一。
菲是环境中存在较广泛的PAHs 污染[2], 主要来源于石油和煤炭加工工业，而菲所特有的K区和湾区结构是多环芳烃具有可致癌性的特征结构[3], 且研究表明，微生物降解是环境中菲去除的主要途径[4]。因此，通过研究菲的降解特性，推测其代谢途径，可以有效的帮助人们了解到其他多环芳烃的代谢机制，从而为污染土壤的微生物修复提供科学依据和基础理论资料。本文以菲为目标污染物，从南京某PAHs污染场地采集植物，旨在从植物根表土壤分离筛选出能以菲为唯一碳源和能源生长的高效菲降解细菌，并研究其在不同环境条件下对菲的降解能力以及成膜能力，明确其在植物根表定殖的潜力，以期为菲污染的生物修复和治理提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验材料
化学试剂: 菲( PHE，纯度≥97%) 为德国Fluka公司出品。甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。
供试植株 (看麦娘) 采自南京某PAHs污染区，植株生长良好，采集后立即带回实验室进行菲降解菌的分离筛选。
1.2培养基
LB培养基 [5]：蛋白胨 10 gL1，酵母粉 5 gL1，NaCl 10 gL1，蒸馏水 1000 mL，pH 7.0 ~ 7.2。固体培养基加2.0%琼脂。121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
无机盐培养基 ( MSM )[6]：(NH4)2SO4 1.50 gL1，K2HPO43H2O 1.91 gL1，KH2PO4 0.50 gL1，MgSO47H2O 0.20 gL1，微量元素溶液2 ml，蒸馏水1000 mL，pH 7.0 ~ 7.2。固体培养基加2.0%琼脂。121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。微量元素溶液：CoCl26H2O 0.1 gL1，MnCl24H2O 0.425 gL1，ZnCl2 0.05 gL1，NiCl26H2O 0.01 gL1，CuSO45H2O 0.015 gL1，Na2MoO42H2O 0.01 gL1，Na2SeO42H2O 0.01 gL1。
菲降解培养基：1mgmL1的菲丙酮溶液过0.22 μm滤膜除菌，取一定量置于灭菌的三角瓶中，待丙酮挥发完，加入已灭菌的MSM培养液，使菲的最终浓度达到实验设计浓度。
1.3具有菲降解功能的植物根表功能细菌的分离筛选
从南京某PAHs污染区采集的看麦娘，取植株根表土壤2 g加入到100 mL菲降解培养基中，150 rmin1、30℃避光摇床培养，每隔7 d转接到新鲜的菲降解培养基中，逐步提高菲降解培养基中菲浓度，转接4次后，取培养液梯度稀释并涂布于以50 mgL1菲丙酮溶液为唯一碳源的无机盐固体培养基（MSM固体培养基），30℃恒温培养，待平板上长出菌落，经反复的分离、筛选和纯化，直至得到典型单菌落。挑选出一株明显降解圈且长势旺盛的菌株，进行菲降解和菌种鉴定试验，并将其命名为PHE2。
1.4植物根表功能细菌的菌悬液制备
将菌株接种到LB液体培养基中，150 rmin1、30℃摇床培养48 h，8000 rmin1离心5 min，弃上清液后，加入无碳源的MSM液体培养基使菌体混合均匀，再次离心，重复2次，用MSM液体培养基调整菌悬液OD600 nm值为0.5，4 ℃备用。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1材料与方法 2
1.1试验材料 2
1.2培养基 2
1.3具有菲降解功能的植物根表功能细菌的分离筛选 2
1.4植物根表功能细菌的菌悬液制备 3
1.5降解菌株的菌种鉴定 3
1.5.1菌体总DNA的提取 3
1.5.2菌株 16S rRNA 基因的 PCR 扩增 3
1.6根表功能细菌对菲的降解特性 3
1.6.1菌株生长和菲降解率的测定 3
1.6.2环境条件对菌株生长和菲降解的影响 3
1.7根表功能细菌的生物学特性 3
1.7.1抗性试验 3
1.7.2菌株成膜能力检测 3
2结果与分析 4
2.1根表功能细菌的鉴定 4
2.1.1菌株PHE2的形态特征 4
2.1.2菌株 16SrRNA 基因序列同源性分析 4
r /> 2.2菲降解根表功能细菌的生长和降解曲线 4
2.3环境条件对菌株生长和菲降解的影响 5
2.3.1温度影响 5
2.3.2 pH影响 6
2.3.3接种量影响 6
2.3.4底物浓度影响 7
2.4抗性实验 7
2.5菌株成膜能力 8
3结论 8
致谢 9
参考文献 9
一株菲降解细菌的分离筛选及其成膜能力和降解特性研究
引言
引言
持久性有机污染物（Persistent Organic Pollutants，POPs）因其具有环境持久性、生物积累性、长距离迁移能力和高生物毒性而对全球环境和人类健康有着巨大威胁。而多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是一类在环境中稳定存在且分布广泛的有机污染物，在POPs中有着重要的地位。PAHs在我国的污染主要体现于被石油污染的大气、土壤和水体中。土壤PAHs污染相比大气污染和水体污染而言，具有长期性、隐蔽性、不可逆性以及不能完全被分解或消逝的特点，因此危害严重、治理困难。找寻有效的办法解决土壤PAHs污染问题越来越受到世界各国的重视[1]。土壤PAHs污染修复技术主要有物理修复、化学修复和微生物修复等，而微生物修复技术由于对环境的影响小，同时能够高效的降低污染物浓度，现已被广泛使用。因此，土壤PAHs高效降解菌的筛选分离是实现PAHs污染土壤微生物修复的关键之一。
菲是环境中存在较广泛的PAHs 污染[2], 主要来源于石油和煤炭加工工业，而菲所特有的K区和湾区结构是多环芳烃具有可致癌性的特征结构[3], 且研究表明，微生物降解是环境中菲去除的主要途径[4]。因此，通过研究菲的降解特性，推测其代谢途径，可以有效的帮助人们了解到其他多环芳烃的代谢机制，从而为污染土壤的微生物修复提供科学依据和基础理论资料。本文以菲为目标污染物，从南京某PAHs污染场地采集植物，旨在从植物根表土壤分离筛选出能以菲为唯一碳源和能源生长的高效菲降解细菌，并研究其在不同环境条件下对菲的降解能力以及成膜能力，明确其在植物根表定殖的潜力，以期为菲污染的生物修复和治理提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验材料
化学试剂: 菲( PHE，纯度≥97%) 为德国Fluka公司出品。甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。
供试植株 (看麦娘) 采自南京某PAHs污染区，植株生长良好，采集后立即带回实验室进行菲降解菌的分离筛选。
1.2培养基
LB培养基 [5]：蛋白胨 10 gL1，酵母粉 5 gL1，NaCl 10 gL1，蒸馏水 1000 mL，pH 7.0 ~ 7.2。固体培养基加2.0%琼脂。121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
无机盐培养基 ( MSM )[6]：(NH4)2SO4 1.50 gL1，K2HPO43H2O 1.91 gL1，KH2PO4 0.50 gL1，MgSO47H2O 0.20 gL1，微量元素溶液2 ml，蒸馏水1000 mL，pH 7.0 ~ 7.2。固体培养基加2.0%琼脂。121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。微量元素溶液：CoCl26H2O 0.1 gL1，MnCl24H2O 0.425 gL1，ZnCl2 0.05 gL1，NiCl26H2O 0.01 gL1，CuSO45H2O 0.015 gL1，Na2MoO42H2O 0.01 gL1，Na2SeO42H2O 0.01 gL1。
菲降解培养基：1mgmL1的菲丙酮溶液过0.22 μm滤膜除菌，取一定量置于灭菌的三角瓶中，待丙酮挥发完，加入已灭菌的MSM培养液，使菲的最终浓度达到实验设计浓度。
1.3具有菲降解功能的植物根表功能细菌的分离筛选
从南京某PAHs污染区采集的看麦娘，取植株根表土壤2 g加入到100 mL菲降解培养基中，150 rmin1、30℃避光摇床培养，每隔7 d转接到新鲜的菲降解培养基中，逐步提高菲降解培养基中菲浓度，转接4次后，取培养液梯度稀释并涂布于以50 mgL1菲丙酮溶液为唯一碳源的无机盐固体培养基（MSM固体培养基），30℃恒温培养，待平板上长出菌落，经反复的分离、筛选和纯化，直至得到典型单菌落。挑选出一株明显降解圈且长势旺盛的菌株，进行菲降解和菌种鉴定试验，并将其命名为PHE2。
1.4植物根表功能细菌的菌悬液制备
将菌株接种到LB液体培养基中，150 rmin1、30℃摇床培养48 h，8000 rmin1离心5 min，弃上清液后，加入无碳源的MSM液体培养基使菌体混合均匀，再次离心，重复2次，用MSM液体培养基调整菌悬液OD600 nm值为0.5，4 ℃备用。
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