转录因子osmads57对水稻氮素营养长距离运输的机制研究(附件)
氮是植物生长和发育过程中所需的营养元素之一，对植物的整个生长过程有着重要的影响，若氮素供应不足则对植物的生长和发育有强烈的影响。实验首先观察在经不加氮、0.2mM NO3-、0.2mM NH4+、5mM NO3-和5mM NH4+处理下的OsMADS57基因的表达结果得出该转录因子的表达受硝酸盐的诱导。而在对15N进行标记后，通过对用0.2mM硝酸盐处理的野生型、OsMADS57突变体和超表达植物的根系和地上部的氮含量浓度进行分析，得出，与野生型植物相比，进过0.2 mM 15N-NO3-供应5分钟OsMADS57突变体根系15N吸收速率差异不显著，说明该基因沉默对硝酸盐的吸收没有影响；供应1个小时OsMADS57突变体根系15N的浓度显著高于野生型，地上部15N的浓度显著低于野生型。进一步研究结果表明，与野生型水稻相比，经过0.2 mM NO3-处理后的OsMADS57突变体伤流液（收集1小时）中NO3-的转运量显著降低。这表明，OsMADS57突变体可能抑制了NO3-从根系向地上部的转运。对野生型和OsMADS57超表达水稻在受0.2 mM 15N-NO3-供应1个小时后的结果表明，OsMADS57超表达地上部15N的浓度显著高于野生型，根系15N的浓度稍降，但差异不显著。这表明OsMADS57参与了硝酸盐从根系往地上部的运输。经qRT-PCR分析OsNRT2硝酸盐转运蛋白基因，显示0.2mM硝酸盐处理5min后，只有OsNRT2.3a（一种NO3-高亲和转运蛋白基因）降低了表达水平。由此证明了OsMADS57在从根到通过OsNRT2.3a的长距离硝酸盐转运过程中起着关键作用。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 2
引言2
1材料与方法3
1.1材料3
1.2方法3
1.2.1载体的构建和水稻的转化3
1.2.2鉴定OsMADS57 TDNA突变体和超表达的谱线3
1.2.3植物材料和生长条件3
1.2.4 OsMADS57基因表达模式的鉴定4
1.2.5 OsMADS57突变体和超表达不同氮浓度条件下对水稻植株生长和氮素积累4
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
1.2.6 OsMADS57突变体和超表达植株不同氮浓度条件下15N的吸收和转运4
1.2.7木质部对硝酸盐含量的分析4
1.2.8用SIET系统对水稻植株中NO3通量率进行测定4
1.2.9数据处理 4
2结果与分析4
2.1 OsMADS57基因表达模式的鉴定5
2.2 OsMADS57突变体和超表达材料的获得及分子鉴定5
2.2.1 OsMADS57突变体材料的获得和分子鉴定5
2.2.2 OsMADS57超表达材料的分子鉴定6
2.3 OsMADS57突变体和超表达材料在不同硝态氮浓度处理下的表型分析及氮素积累7
2.4 OMADS57突变体和超表达植株对15N的吸收与转运8
2.5 OsMADS57突变体和超表达植株相关基因的表达 11
3讨论 11
致谢12
参考文献13
转录因子OsMADS57对水稻氮素营养长距离运输的机制研究
引言
植物在其生长过程中需要的重要营养元素之一是氮（N），氮可以构成植物生长过程中需要的核酸和蛋白质等大分子，且在整个植物生命周期中发挥着重要的作用，如果氮元素营养不足，就会影响植物的发育和生长[1][2][3]。大部分非豆科植物在产生1 kg干物质是必须要在土壤中吸收2050g的氮，因此在自然条件下，土壤氮素供应成为农业生产的限制因子[4]。通常提高水稻产量的最直接方式就是氮肥的大量施用[5][6]，但随着氮肥的加大施入和作物产量的提高，将出现如氮肥利用率低，氮肥大量损失以及造成的环境问题等问题[7]。因此，研究水稻氮高效吸收利用的分子机制，挖掘水稻自身氮高效吸收利用新基因，进而获得水稻氮高效新品种具有重要的意义和广阔的前景。
土壤中的无机氮一般主要以铵态氮（NH4+）和硝态氮（NO3）两种形式存在。旱地植物一般生长在好氧的环境中，主要以NO3为主。但水稻由于在前期主要生长在淹水环境中，硝化作用受到抑制，土壤中的氮主要以NH4+为主，一般认为水稻是喜铵作物[8][9]，因此前人对水稻N营养的研究主要集中在NH4+而忽略了NO3。
植物通过H+/ NO3共转运跨膜吸收NO3，该过程主动耗能[10][11]。在外界NO3浓度不同的情况下，植物为适应环境而进化形成两种不同的硝酸盐运输系统。据研究表明，当外界NO3浓度在1 μM1 mM时，植物主要由自身高亲和运输系统（HATS）负责NO3的吸收；而当外界NO3浓度大于1 mM时，主要由低亲和运输系统（LATS）负责其功能[12]。这两种运输系统又进一步被划分为诱导型和组成型[13][14][15]。目前，已有研究得出，水稻中已克隆的高亲和NO3运输蛋白基因有OsNRT2.1/2.2/2.3/2.4和OsNAR2.1/2.2 [16][20]。。NO3能够诱导OsNAR2.1和OsNRT2.1/2.2/2.3a的表达。目前比较明确的是水稻高亲和OsNRT2.3a，主要负责NO3从根系到地上部的运输[20]。
本研究以OsMADS57转录因子为研究对象，旨在明晰OsMADS57转录因子对水稻中氮素营养的长距离运输的机制,以此作为日后对水稻氮素营养吸收利用的基础。
1、材料与方法
1.1材料
供试水稻品种：野生型水稻冬粳（cv. Dongjin）；冬粳背景的TDNA插入突变体：m1和m2。主要试剂：Ca(15NO3)2，atm%=40%（上海化工研究院）；Trizol（Invitrogen）；逆转录酶MMLV（Fermentas）；Taq DNA polymerase、dNTP、内切酶BamHI、SacI、T4 DNA连接酶（Takara）。
OsMADS57 TDNA插入突变体的获得：购自韩国水稻突变体库
（http://signal.salk.edu/cgibin/RiceGE）
供试菌株：大肠杆菌（Escherichi.coli.DH5α）和根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens. EHA105）均由本实验室提供。
1.2方法
1.2.1 载体的构建和水稻转化 对于超表达结构，用引物MADS57OxF和MADS57OxR对OsMADS57进行全长cDNA扩增，然后插入载体pTCK303的BamHI和Sacl位点。为OsMADS57启动子和GUS编码序列的融合构建（pOsMADS57GUS），用引物MADS57GUSF和MADS57GUSR从冬粳DNA基因组中最接近上游地区中扩增出从OsMADS57的ATG起始密码子开始的2.95kb的启动子，并把它插入引物pS1aGUS3的Pacl和Ascl位点。这些构建物被引入了根癌农杆菌，并被转化为冬粳水稻成熟种子的愈伤组织。然后在50mg/L潮霉素的存在下进行转基因株系（T1代）的选择，并进行GUS染色分析。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 2
引言2
1材料与方法3
1.1材料3
1.2方法3
1.2.1载体的构建和水稻的转化3
1.2.2鉴定OsMADS57 TDNA突变体和超表达的谱线3
1.2.3植物材料和生长条件3
1.2.4 OsMADS57基因表达模式的鉴定4
1.2.5 OsMADS57突变体和超表达不同氮浓度条件下对水稻植株生长和氮素积累4
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
1.2.6 OsMADS57突变体和超表达植株不同氮浓度条件下15N的吸收和转运4
1.2.7木质部对硝酸盐含量的分析4
1.2.8用SIET系统对水稻植株中NO3通量率进行测定4
1.2.9数据处理 4
2结果与分析4
2.1 OsMADS57基因表达模式的鉴定5
2.2 OsMADS57突变体和超表达材料的获得及分子鉴定5
2.2.1 OsMADS57突变体材料的获得和分子鉴定5
2.2.2 OsMADS57超表达材料的分子鉴定6
2.3 OsMADS57突变体和超表达材料在不同硝态氮浓度处理下的表型分析及氮素积累7
2.4 OMADS57突变体和超表达植株对15N的吸收与转运8
2.5 OsMADS57突变体和超表达植株相关基因的表达 11
3讨论 11
致谢12
参考文献13
转录因子OsMADS57对水稻氮素营养长距离运输的机制研究
引言
植物在其生长过程中需要的重要营养元素之一是氮（N），氮可以构成植物生长过程中需要的核酸和蛋白质等大分子，且在整个植物生命周期中发挥着重要的作用，如果氮元素营养不足，就会影响植物的发育和生长[1][2][3]。大部分非豆科植物在产生1 kg干物质是必须要在土壤中吸收2050g的氮，因此在自然条件下，土壤氮素供应成为农业生产的限制因子[4]。通常提高水稻产量的最直接方式就是氮肥的大量施用[5][6]，但随着氮肥的加大施入和作物产量的提高，将出现如氮肥利用率低，氮肥大量损失以及造成的环境问题等问题[7]。因此，研究水稻氮高效吸收利用的分子机制，挖掘水稻自身氮高效吸收利用新基因，进而获得水稻氮高效新品种具有重要的意义和广阔的前景。
土壤中的无机氮一般主要以铵态氮（NH4+）和硝态氮（NO3）两种形式存在。旱地植物一般生长在好氧的环境中，主要以NO3为主。但水稻由于在前期主要生长在淹水环境中，硝化作用受到抑制，土壤中的氮主要以NH4+为主，一般认为水稻是喜铵作物[8][9]，因此前人对水稻N营养的研究主要集中在NH4+而忽略了NO3。
植物通过H+/ NO3共转运跨膜吸收NO3，该过程主动耗能[10][11]。在外界NO3浓度不同的情况下，植物为适应环境而进化形成两种不同的硝酸盐运输系统。据研究表明，当外界NO3浓度在1 μM1 mM时，植物主要由自身高亲和运输系统（HATS）负责NO3的吸收；而当外界NO3浓度大于1 mM时，主要由低亲和运输系统（LATS）负责其功能[12]。这两种运输系统又进一步被划分为诱导型和组成型[13][14][15]。目前，已有研究得出，水稻中已克隆的高亲和NO3运输蛋白基因有OsNRT2.1/2.2/2.3/2.4和OsNAR2.1/2.2 [16][20]。。NO3能够诱导OsNAR2.1和OsNRT2.1/2.2/2.3a的表达。目前比较明确的是水稻高亲和OsNRT2.3a，主要负责NO3从根系到地上部的运输[20]。
本研究以OsMADS57转录因子为研究对象，旨在明晰OsMADS57转录因子对水稻中氮素营养的长距离运输的机制,以此作为日后对水稻氮素营养吸收利用的基础。
1、材料与方法
1.1材料
供试水稻品种：野生型水稻冬粳（cv. Dongjin）；冬粳背景的TDNA插入突变体：m1和m2。主要试剂：Ca(15NO3)2，atm%=40%（上海化工研究院）；Trizol（Invitrogen）；逆转录酶MMLV（Fermentas）；Taq DNA polymerase、dNTP、内切酶BamHI、SacI、T4 DNA连接酶（Takara）。
OsMADS57 TDNA插入突变体的获得：购自韩国水稻突变体库
（http://signal.salk.edu/cgibin/RiceGE）
供试菌株：大肠杆菌（Escherichi.coli.DH5α）和根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens. EHA105）均由本实验室提供。
1.2方法
1.2.1 载体的构建和水稻转化 对于超表达结构，用引物MADS57OxF和MADS57OxR对OsMADS57进行全长cDNA扩增，然后插入载体pTCK303的BamHI和Sacl位点。为OsMADS57启动子和GUS编码序列的融合构建（pOsMADS57GUS），用引物MADS57GUSF和MADS57GUSR从冬粳DNA基因组中最接近上游地区中扩增出从OsMADS57的ATG起始密码子开始的2.95kb的启动子，并把它插入引物pS1aGUS3的Pacl和Ascl位点。这些构建物被引入了根癌农杆菌，并被转化为冬粳水稻成熟种子的愈伤组织。然后在50mg/L潮霉素的存在下进行转基因株系（T1代）的选择，并进行GUS染色分析。
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