小球藻对砷的吸收和代谢的研究(附件)
摘要：本课题通过实验室培养，选取了9个不同浓度的As(Ⅲ)和12个不同浓度的As(Ⅴ)的培养处理，以在680 nm 下小球藻的吸光度（OD680）作为衡量因子，对小球藻小球藻在不同浓度砷的培养液中的生长情况进行了试验。结果表明，小球藻可利用自身的生理机制，在3d内解除低浓As(III)(≦200ppm)和As(V)(≦200ppm)对其生长抑制作用，使As(III)和As(V)对藻体本身不至于造成很大的毒害作用。而对于高浓度的As(III)和As(V)，藻体的解毒需要更长的时间。参照藻类生长抑制评价标准。As（Ⅲ）对小球藻的毒性比As（Ⅴ）大。通过实验，随着As(III)处理浓度的升高，小球藻对As(III)的富集量呈上升趋势，1d与2d的富集量呈现相对下降的趋势，这可能是小球藻在富集As(III)的过程中出现了外排作用。随着As(V)处理浓度的升高，小球藻对As(V)的富集量呈上升趋势，在同一浓度处理下，随天数的累积，小球藻对As(V)的富集量也随之上升。当As(V)处理浓度达20ppb与30ppb时，小球藻富集量的增加量较低，这可能是由于小球藻对As(V)产生了一定的抗性。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words2
引言2
1 材料与方法3
1.1研究材料 3
1.2培养条件4
1.3实验方案4
1.3.1不同砷浓度下小球藻的生长及生理指标测定 4
1.3.2小球藻中总砷的测定 4
1.3.3 不同砷浓度下小球藻对砷的富集4
1.3.4 72h生长抑制实验 4
2 结果与分析4
2．1小球藻的生长曲线4
2．2 OD值与细胞干重5
2.3 MOPS缓冲液对pH值的影响5
2.4 小球藻细胞数与OD的线性关系6
2.5 总砷的测定6
2.6 72h生长抑制实验 7
2.7 As的富集9
3 讨论 10
3.1小球藻对砷的抗性10
3.2砷对小球藻生长的影响10
致谢10
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
参考文献11
小球藻对砷的吸收和代谢的研究
引言
引言：砷是广泛存在于自然界中最常见的毒性污染物。海水中的平均砷浓度为12μg/L，且变化很小【1】，形态以无机砷[亚砷酸盐As(III)和砷酸盐As(V)为主【12】。近年来，人为来源加上自然来源导致砷大范围扩散到地表、地下水及引用水中，淡水水体中砷含量从低于1μg/L到10μg/L，在已报道的受污染的地下水中含量达5000μg/L【3】。砷主要以硫化物的形式存在于自然界中，如雄黄和雌黄。在生物体中，砷以三价和五价状态存在。三价砷在体内可以转化为甲基砷或甲基砷化物。在超级基金危险物质表中位列第一[34]。在自然水体中，常以+V、+III的形态存在。由于砷有不同的原子价态，因此毒性也各异。此外，砷的毒性不只取决于它们的总量，还与砷的化学形态有很大关系。单质砷，因不溶于水，侵入人体不被吸收，所以危害很小；有机砷化物，除砷化氢的衍生物外，对生物体并没有毒性。三价砷化合物对细胞的毒性最强，五价砷化合物毒性最弱【5】。
藻类作为水生生态系统的初级生产者，对水生生态系统的平衡和稳定起着很重要的作用，藻类测试是生态毒理学研究中不可或缺的方法，且其本身具有生长周期短、易于分离培养、可以直接观察细胞水平上的中毒症状等特点，因此是理想的毒性测试材料[6]
。小球藻其属绿藻小球藻科 ，是一种单细胞绿色微小淡水藻类，细胞形体为圆形或椭圆形，细胞直径 212μm，每个细胞为一个具真核的完整结构的自养型有机体。小球藻生态分布广，易于培养，是环境中生长最快速、最易得的藻类，是进行生物技术研究理想材料，而且营养丰富，是很好的单细胞蛋白(SCP)。因此小球藻具有很高的应用价值【7】 。
本文利用小球藻作为受试生物藻种，研究了As(III)和As(V)对小球藻的毒性效应及小球藻对As(III)与As(V)的富集作用 。
1 材料与方法
1．1 研究材料
（1）藻种
小球藻（Chlorella pyrenoidosa)，网上订购，由中国科学院武汉水生生物研究所提供。
（2）主要仪器
冷冻离心机、冷冻干燥仪、SA10型原子荧光形态分析仪(北京吉天仪器有限公司)等。
所用试剂
BG11培养基； 磷酸氢二铵、过硫酸钾、硼氢化钾、氢氧化钾、硫脲（Amresco）、抗坏血酸（Sigma）均为分析纯；盐酸为优级纯；甲醇为色谱纯 。
1．2 培养条件
对小球藻采用BG11培养基培养，调节培养液pH 7.1。培养条件白天T 30℃，晚上T 25℃。白天光照强度：4000lx。光照明暗比 12h : 12h。在藻种传代及培养过程中，均严格遵循无菌操作。在LB培养板上用接种环划板，密封平板，30℃下培养，观察是否有菌存在，并挑取单菌落群培养小球藻，即小球藻的纯化。本实验采取LB培养法进行无菌检验，确保实验结果准确可靠。
1. 3 实验方案
1.3.1 不同砷浓度下小球藻的生长及生理指标测定
分别设置不同浓度的As(V)和As(III)进行处理，经过培养，分别研究As(V)和As(III)对小球藻生物量，OD值，细胞数，干重量等生理指标的影响，确定As(V)和As(III)对小球藻的毒性效应，确定适合和抑制微藻生长的处理组合。
1.3.2 72h生长抑制实验
按实验设置毒物浓度，向配制好的培养基中加入As 溶液作为藻体培养液，使As（Ⅲ）浓度最终质量浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 和20.0 mg/L；使As（Ⅴ）浓
度最终质量浓度为1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 和100.0mg/L。
实验采用50 mL 的广口三角锥形瓶，所有三角瓶用无菌封口膜封住瓶口，每个浓度设置3 个平行样，121 ℃高压灭菌30 min，接种前再在超净台内紫外线灭菌30 min。所有实验体系均在经改造的台式冷冻恒温振荡器内培养（150 r/min），培养温度为(25±2) ℃，光强为(3 000±500) lx，光暗为12 h：12 h，整个实验确保无菌操作。整个实验共进行了7 d，每隔24 h 用显微镜计数。
1.3.3 小球藻中总砷的测定
（1）藻体的测量
将藻体鲜样(之前于30℃冰箱中冷藏)提前30分钟取出，加入2mL体积比为4：1的HNO3：HClO4混合酸，静置过夜，采用Lab Tech ED54型智能样品消解仪（莱佰泰科有限公司）电热消解至溶液澄清透明，打开消煮管塞进行赶酸至消煮管内剩余0.2mL左右溶液时，取出消煮管静置冷却，用去离子水润洗移至5mL容量瓶中，加0.25mL2.5%浓盐酸（优级纯）和0.5mL10%硫脲+10%抗坏血酸混合溶液，定容至5mL。用氢化物发生—双道原子荧光光度计（HGAFS）测其总砷含量，以同批次藻样，相同步骤加标消解进行加标回收。
（2）培养液的测量
取一定量的培养液（1mL），加0.5mL10%硫脲+10%抗坏血酸混合溶液与0.25mL的浓盐酸，定容至5mL，即稀释了10倍。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words2
引言2
1 材料与方法3
1.1研究材料 3
1.2培养条件4
1.3实验方案4
1.3.1不同砷浓度下小球藻的生长及生理指标测定 4
1.3.2小球藻中总砷的测定 4
1.3.3 不同砷浓度下小球藻对砷的富集4
1.3.4 72h生长抑制实验 4
2 结果与分析4
2．1小球藻的生长曲线4
2．2 OD值与细胞干重5
2.3 MOPS缓冲液对pH值的影响5
2.4 小球藻细胞数与OD的线性关系6
2.5 总砷的测定6
2.6 72h生长抑制实验 7
2.7 As的富集9
3 讨论 10
3.1小球藻对砷的抗性10
3.2砷对小球藻生长的影响10
致谢10
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
参考文献11
小球藻对砷的吸收和代谢的研究
引言
引言：砷是广泛存在于自然界中最常见的毒性污染物。海水中的平均砷浓度为12μg/L，且变化很小【1】，形态以无机砷[亚砷酸盐As(III)和砷酸盐As(V)为主【12】。近年来，人为来源加上自然来源导致砷大范围扩散到地表、地下水及引用水中，淡水水体中砷含量从低于1μg/L到10μg/L，在已报道的受污染的地下水中含量达5000μg/L【3】。砷主要以硫化物的形式存在于自然界中，如雄黄和雌黄。在生物体中，砷以三价和五价状态存在。三价砷在体内可以转化为甲基砷或甲基砷化物。在超级基金危险物质表中位列第一[34]。在自然水体中，常以+V、+III的形态存在。由于砷有不同的原子价态，因此毒性也各异。此外，砷的毒性不只取决于它们的总量，还与砷的化学形态有很大关系。单质砷，因不溶于水，侵入人体不被吸收，所以危害很小；有机砷化物，除砷化氢的衍生物外，对生物体并没有毒性。三价砷化合物对细胞的毒性最强，五价砷化合物毒性最弱【5】。
藻类作为水生生态系统的初级生产者，对水生生态系统的平衡和稳定起着很重要的作用，藻类测试是生态毒理学研究中不可或缺的方法，且其本身具有生长周期短、易于分离培养、可以直接观察细胞水平上的中毒症状等特点，因此是理想的毒性测试材料[6]
。小球藻其属绿藻小球藻科 ，是一种单细胞绿色微小淡水藻类，细胞形体为圆形或椭圆形，细胞直径 212μm，每个细胞为一个具真核的完整结构的自养型有机体。小球藻生态分布广，易于培养，是环境中生长最快速、最易得的藻类，是进行生物技术研究理想材料，而且营养丰富，是很好的单细胞蛋白(SCP)。因此小球藻具有很高的应用价值【7】 。
本文利用小球藻作为受试生物藻种，研究了As(III)和As(V)对小球藻的毒性效应及小球藻对As(III)与As(V)的富集作用 。
1 材料与方法
1．1 研究材料
（1）藻种
小球藻（Chlorella pyrenoidosa)，网上订购，由中国科学院武汉水生生物研究所提供。
（2）主要仪器
冷冻离心机、冷冻干燥仪、SA10型原子荧光形态分析仪(北京吉天仪器有限公司)等。
所用试剂
BG11培养基； 磷酸氢二铵、过硫酸钾、硼氢化钾、氢氧化钾、硫脲（Amresco）、抗坏血酸（Sigma）均为分析纯；盐酸为优级纯；甲醇为色谱纯 。
1．2 培养条件
对小球藻采用BG11培养基培养，调节培养液pH 7.1。培养条件白天T 30℃，晚上T 25℃。白天光照强度：4000lx。光照明暗比 12h : 12h。在藻种传代及培养过程中，均严格遵循无菌操作。在LB培养板上用接种环划板，密封平板，30℃下培养，观察是否有菌存在，并挑取单菌落群培养小球藻，即小球藻的纯化。本实验采取LB培养法进行无菌检验，确保实验结果准确可靠。
1. 3 实验方案
1.3.1 不同砷浓度下小球藻的生长及生理指标测定
分别设置不同浓度的As(V)和As(III)进行处理，经过培养，分别研究As(V)和As(III)对小球藻生物量，OD值，细胞数，干重量等生理指标的影响，确定As(V)和As(III)对小球藻的毒性效应，确定适合和抑制微藻生长的处理组合。
1.3.2 72h生长抑制实验
按实验设置毒物浓度，向配制好的培养基中加入As 溶液作为藻体培养液，使As（Ⅲ）浓度最终质量浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 和20.0 mg/L；使As（Ⅴ）浓
度最终质量浓度为1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 和100.0mg/L。
实验采用50 mL 的广口三角锥形瓶，所有三角瓶用无菌封口膜封住瓶口，每个浓度设置3 个平行样，121 ℃高压灭菌30 min，接种前再在超净台内紫外线灭菌30 min。所有实验体系均在经改造的台式冷冻恒温振荡器内培养（150 r/min），培养温度为(25±2) ℃，光强为(3 000±500) lx，光暗为12 h：12 h，整个实验确保无菌操作。整个实验共进行了7 d，每隔24 h 用显微镜计数。
1.3.3 小球藻中总砷的测定
（1）藻体的测量
将藻体鲜样(之前于30℃冰箱中冷藏)提前30分钟取出，加入2mL体积比为4：1的HNO3：HClO4混合酸，静置过夜，采用Lab Tech ED54型智能样品消解仪（莱佰泰科有限公司）电热消解至溶液澄清透明，打开消煮管塞进行赶酸至消煮管内剩余0.2mL左右溶液时，取出消煮管静置冷却，用去离子水润洗移至5mL容量瓶中，加0.25mL2.5%浓盐酸（优级纯）和0.5mL10%硫脲+10%抗坏血酸混合溶液，定容至5mL。用氢化物发生—双道原子荧光光度计（HGAFS）测其总砷含量，以同批次藻样，相同步骤加标消解进行加标回收。
（2）培养液的测量
取一定量的培养液（1mL），加0.5mL10%硫脲+10%抗坏血酸混合溶液与0.25mL的浓盐酸，定容至5mL，即稀释了10倍。
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