产碱假单胞菌nbrc14159的砷甲基化功能鉴定
摘要：微生物在砷的地球化学循环中具有十分重要的作用，微生物对砷的氧化、还原和甲基化等作用极大地影响着砷在环境中迁移转化。本论文以产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes NBRC14159)为研究对象，验证该菌株的砷甲基化功能及其是否赋予敲除菌株和砷敏感大肠杆菌砷抗性。结果表明产碱假单胞菌NBRC14159可以将As(III)甲基化为二甲基砷(DMA)以及少量的三甲基砷(TMAO)。当该菌的arsM基因被敲除后，该突变菌株丧失了砷甲基化功能，并且对As(III)更加敏感。将该基因在砷敏感的大肠杆菌中表达，可以提高大肠杆菌对As(III)的抗性，并且使大肠杆菌获得了砷甲基化的能力。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 文献综述 2
1．1 砷的来源和污染 2
1．2 砷的形态及毒性 3
1．3 砷的地球化学循环 4
1．4 砷污染的危害 4
1．4．1 砷对植物的影响 4
1．4．2 砷对微生物的影响 4
1．4．3 砷对人体的影响 4
1．5 砷污染的修复方法 4
1．6 砷的微生物转化机制 5
1．6．1 微生物对砷的氧化作用 5
1．6．2 微生物对砷的还原作用 5
1．6．3 微生物对砷的甲基化作用 6
1．7 产碱假单胞菌 6
1．8 研究目的及意义 6
1．9 研究内容和技术路线 7
1．9．1 主要研究内容 7
1．9．2 技术路线 7
2 材料与方法 7
2．1 材料 7
2．2 方法 8
2．2．1 P. alcaligenes NBRC14159对As(III)的转化 8
2．2．2 P. alcaligenes菌株的ArsM酶基因克隆 8
2．2．3 P. alcaligenes arsM基因敲除菌株的构建 9
2．2．4 原始菌株和突变菌株PaΔ
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
arsM的砷抗性比较 9
2．2．5 表达质粒的构建和E.coli AW3110 (ΔarsRBC)感受态细胞的转化 9
2．2．6 表达PaarsM基因的E.coli AW3110(DE3)对As(III)的抗性研究 9
2．2．7 表达PaarsM基因的E.coli AW3110(DE3)对砷的甲基化能力 10
3 结果与分析 10
3．1 P. alcaligenes NBRC14159对As(III)的转化 10
3．2 突变菌株PaΔarsM的砷抗性 11
3．3 表达PaarsM基因的大肠杆菌AW3110(DE3)对As(III)的抗性 11
3．4 表达PaarsM基因的大肠杆菌AW3110(DE3)对As(III)的转化结果 12
4 讨论 13
致谢 13
参考文献 13
产碱假单胞菌NBRC14159的砷甲基化功能鉴定
引言
引言
砷是一种剧毒物质，在美国超级基金名单的危害物质中排在第一位(Qin et al., 2009)。土壤中的砷由于存在广泛，不能被降解，因此易于在土壤中积累，并通过食物链进入动物、人体内，对人体健康存在潜在威胁，因此长期以来备受关注。
砷的来源有自然来源和人为来源。环境中的砷主要来源于人类活动，如矿产的开采、含砷农药化肥的使用以及砷元素的工业制造。自然界中存在着各种形态的砷，包括砷化氢(AsH3)、亚砷酸盐(As(III))、砷酸盐(As(V))等无机砷和单甲基胂(MMA)、二甲基胂(DMA)和三甲基胂(TMA))等有机砷。此外在海洋生物和藻类中还存在砷胆碱、砷甜菜碱、砷糖等无毒的有机态(Cullen et al., 1989)。无机砷和甲基砷均存在着三价和五价之间的价态变化。只有在极端条件下，毒性很强的砷化氢才会生成，因此自然环境中的砷化氢比较少见。
随着社会经济和工业的发展，越来越多的砷被排放到自然环境中，砷污染现象愈发严重，威胁着人类健康。饮用水的砷污染可能是造成人体砷中毒重要的原因。全球范围内已经有超过1亿人所饮用的水受到了砷污染，许多国家已经将饮用水中砷的安全浓度由50 μgL1降低到10 μgL1。在亚洲地区，水稻是人们主要的粮食作物，由于其淹水的种植方式，土壤中砷的有效性很高，水稻对砷的吸收能力较强，砷在水稻籽粒中逐渐积累，并通过食物链进入人体内。研究表明，长期暴露在砷污染的环境中会导致砷的慢性中毒，主要是对皮肤、肝、肺脏的损害。砷对皮肤的损伤主要表现为色素沉着和皮肤脱失、角化过度和细胞癌变。
在与砷长期共存过程中，微生物对砷形成了不同的转化机制，包括氧化、还原以及甲基化等作用。在氧化条件下，微生物可以将毒性较高、迁移能力较强的As(III)氧化为毒性较低、迁移能力较弱的As(V)，从而降低环境中的砷污染；在还原条件下，微生物将吸附在粘粒矿物上的As(V)还原为As(III)，从而加重环境砷污染；砷的甲基化较为复杂，但其产物通常是毒性较低的有机砷，如DMA(V)和MMA(V)，因此砷的甲基化对环境中砷污染的修复具有重要意义。砷的氧化、还原以及甲基化作用都受基因调控，如arsC、arsM、arr等。
本研究旨在验证产碱假单胞菌NBRC14159的砷甲基化功能以及其arsM基因是否赋予其它微生物砷抗性和甲基化能力。在一定程度上，为促进砷的生物修复提供依据，减轻全球地下水和土壤的砷污染风险，从而保护人类健康。
1 文献综述
1．1 砷的来源和污染
砷(元素符号As)，俗称砒，是一种非金属元素，原子序数是33，在元素周期表中位于第四周期、第VA族，相对原子质量为74.92，熔点为808oC，沸点为603oC。砷元素广泛存在于在土壤、水体及大气中，地球环境中砷的储量为3×108 t。砷在地壳中的丰度占元素第20 位，平均含量为25 mgkg1，在海水中居第14 位，在人体内排第12 位。土壤中砷的来源分为自然来源和人为来源。自然来源主要就是土壤中砷元素的背景值，除了个别地区外，绝大多数土壤中砷的本底值一般小于15 mgkg1(蒋成爱等，2004)。在地壳中，砷有时以游离态存在，但主要还是以硫化物的形式存在，大约有六七十种，如雄黄(As4S4)、雌黄(As2S3)、黄铁矿(FeAsS)等。另外，一些自然活动如岩石的风化、森林火灾、火山爆发、微生物的活动以及土壤侵蚀等活动都会产生许多含砷物质。据估计，全球每年从岩石风化和海洋喷溅释放出来的砷总量为(1.4～5.6)×105kg(陈怀满，2005)。
土壤中大量的砷主要来源于人类活动。随着工业的发展，砷及其衍生物被广泛应用于生产制造业，如电子产品等(Sadler et al., 1994 )。同时，砷矿常常作为一些金属矿物的伴生矿，煤炭中也含有大量的砷，因此，金属采矿和煤炭开采活动也会将砷释放到土壤、水体和大气环境中(Smith et al., 1998)。在我国南方的一些地区，如湖南、广西、广东等地由于不当的采矿活动，大量的砷矿物从地壳中释放出来，然后经过风化作用进入周围的水体和土壤中。另外，农业生产中施用的含砷农药、化肥、除草剂以及含砷污水的灌溉也是土壤中砷的一类重要来源。磷肥中的砷含量一般为2050 mgkg1，而一些复合肥中的含量会更高。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 文献综述 2
1．1 砷的来源和污染 2
1．2 砷的形态及毒性 3
1．3 砷的地球化学循环 4
1．4 砷污染的危害 4
1．4．1 砷对植物的影响 4
1．4．2 砷对微生物的影响 4
1．4．3 砷对人体的影响 4
1．5 砷污染的修复方法 4
1．6 砷的微生物转化机制 5
1．6．1 微生物对砷的氧化作用 5
1．6．2 微生物对砷的还原作用 5
1．6．3 微生物对砷的甲基化作用 6
1．7 产碱假单胞菌 6
1．8 研究目的及意义 6
1．9 研究内容和技术路线 7
1．9．1 主要研究内容 7
1．9．2 技术路线 7
2 材料与方法 7
2．1 材料 7
2．2 方法 8
2．2．1 P. alcaligenes NBRC14159对As(III)的转化 8
2．2．2 P. alcaligenes菌株的ArsM酶基因克隆 8
2．2．3 P. alcaligenes arsM基因敲除菌株的构建 9
2．2．4 原始菌株和突变菌株PaΔ
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
arsM的砷抗性比较 9
2．2．5 表达质粒的构建和E.coli AW3110 (ΔarsRBC)感受态细胞的转化 9
2．2．6 表达PaarsM基因的E.coli AW3110(DE3)对As(III)的抗性研究 9
2．2．7 表达PaarsM基因的E.coli AW3110(DE3)对砷的甲基化能力 10
3 结果与分析 10
3．1 P. alcaligenes NBRC14159对As(III)的转化 10
3．2 突变菌株PaΔarsM的砷抗性 11
3．3 表达PaarsM基因的大肠杆菌AW3110(DE3)对As(III)的抗性 11
3．4 表达PaarsM基因的大肠杆菌AW3110(DE3)对As(III)的转化结果 12
4 讨论 13
致谢 13
参考文献 13
产碱假单胞菌NBRC14159的砷甲基化功能鉴定
引言
引言
砷是一种剧毒物质，在美国超级基金名单的危害物质中排在第一位(Qin et al., 2009)。土壤中的砷由于存在广泛，不能被降解，因此易于在土壤中积累，并通过食物链进入动物、人体内，对人体健康存在潜在威胁，因此长期以来备受关注。
砷的来源有自然来源和人为来源。环境中的砷主要来源于人类活动，如矿产的开采、含砷农药化肥的使用以及砷元素的工业制造。自然界中存在着各种形态的砷，包括砷化氢(AsH3)、亚砷酸盐(As(III))、砷酸盐(As(V))等无机砷和单甲基胂(MMA)、二甲基胂(DMA)和三甲基胂(TMA))等有机砷。此外在海洋生物和藻类中还存在砷胆碱、砷甜菜碱、砷糖等无毒的有机态(Cullen et al., 1989)。无机砷和甲基砷均存在着三价和五价之间的价态变化。只有在极端条件下，毒性很强的砷化氢才会生成，因此自然环境中的砷化氢比较少见。
随着社会经济和工业的发展，越来越多的砷被排放到自然环境中，砷污染现象愈发严重，威胁着人类健康。饮用水的砷污染可能是造成人体砷中毒重要的原因。全球范围内已经有超过1亿人所饮用的水受到了砷污染，许多国家已经将饮用水中砷的安全浓度由50 μgL1降低到10 μgL1。在亚洲地区，水稻是人们主要的粮食作物，由于其淹水的种植方式，土壤中砷的有效性很高，水稻对砷的吸收能力较强，砷在水稻籽粒中逐渐积累，并通过食物链进入人体内。研究表明，长期暴露在砷污染的环境中会导致砷的慢性中毒，主要是对皮肤、肝、肺脏的损害。砷对皮肤的损伤主要表现为色素沉着和皮肤脱失、角化过度和细胞癌变。
在与砷长期共存过程中，微生物对砷形成了不同的转化机制，包括氧化、还原以及甲基化等作用。在氧化条件下，微生物可以将毒性较高、迁移能力较强的As(III)氧化为毒性较低、迁移能力较弱的As(V)，从而降低环境中的砷污染；在还原条件下，微生物将吸附在粘粒矿物上的As(V)还原为As(III)，从而加重环境砷污染；砷的甲基化较为复杂，但其产物通常是毒性较低的有机砷，如DMA(V)和MMA(V)，因此砷的甲基化对环境中砷污染的修复具有重要意义。砷的氧化、还原以及甲基化作用都受基因调控，如arsC、arsM、arr等。
本研究旨在验证产碱假单胞菌NBRC14159的砷甲基化功能以及其arsM基因是否赋予其它微生物砷抗性和甲基化能力。在一定程度上，为促进砷的生物修复提供依据，减轻全球地下水和土壤的砷污染风险，从而保护人类健康。
1 文献综述
1．1 砷的来源和污染
砷(元素符号As)，俗称砒，是一种非金属元素，原子序数是33，在元素周期表中位于第四周期、第VA族，相对原子质量为74.92，熔点为808oC，沸点为603oC。砷元素广泛存在于在土壤、水体及大气中，地球环境中砷的储量为3×108 t。砷在地壳中的丰度占元素第20 位，平均含量为25 mgkg1，在海水中居第14 位，在人体内排第12 位。土壤中砷的来源分为自然来源和人为来源。自然来源主要就是土壤中砷元素的背景值，除了个别地区外，绝大多数土壤中砷的本底值一般小于15 mgkg1(蒋成爱等，2004)。在地壳中，砷有时以游离态存在，但主要还是以硫化物的形式存在，大约有六七十种，如雄黄(As4S4)、雌黄(As2S3)、黄铁矿(FeAsS)等。另外，一些自然活动如岩石的风化、森林火灾、火山爆发、微生物的活动以及土壤侵蚀等活动都会产生许多含砷物质。据估计，全球每年从岩石风化和海洋喷溅释放出来的砷总量为(1.4～5.6)×105kg(陈怀满，2005)。
土壤中大量的砷主要来源于人类活动。随着工业的发展，砷及其衍生物被广泛应用于生产制造业，如电子产品等(Sadler et al., 1994 )。同时，砷矿常常作为一些金属矿物的伴生矿，煤炭中也含有大量的砷，因此，金属采矿和煤炭开采活动也会将砷释放到土壤、水体和大气环境中(Smith et al., 1998)。在我国南方的一些地区，如湖南、广西、广东等地由于不当的采矿活动，大量的砷矿物从地壳中释放出来，然后经过风化作用进入周围的水体和土壤中。另外，农业生产中施用的含砷农药、化肥、除草剂以及含砷污水的灌溉也是土壤中砷的一类重要来源。磷肥中的砷含量一般为2050 mgkg1，而一些复合肥中的含量会更高。
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