一株芘降解根际细菌的筛选及其在植物根表的定殖对植物吸收芘的影响
本研究从PAHs污染场地健康植物根表筛选获得了一株具有芘降解功能的细菌Pyr9，鉴定了功能细菌的分类地位，并研究了其生长和降解特性；用绿色荧光蛋白基因(gfp)标记对Pyr9进行标记，将其定殖在植物根表，研究了功能菌株在植物根表的定殖分布及其对植物吸收积累PAHs影响。主要研究结果如下经生理生化测定及16S rDNA基因序列同源性分析，菌株Pyr9为具有芘降解能力的Mycobacterium sp. 细菌。并且测定其生长曲线和降解曲线，Pyr9在10d之内对芘的降解率到达97%。用绿色荧光蛋白基因(gfp)对菌株Pyr9进行了标记并将其定殖到三叶草根表，发现功能细菌Pyr9-gfp可以在三叶草根表定殖并形成细菌生物膜，且其在根表的定殖显著提高了植物茎叶和根部生物量，根和茎生物量分别增长了25%和19%，茎和根中的芘浓度分别降低42%和30%，积累量降低31%和13%，富集系数分别降低31%和16%，芘的去除率提高了41%。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract. 1
Key words 1
1引言 2
2材料与方法 2
2.1试剂和培养基 2
2.2 植物样品采集 2
2.3 功能菌株的分离筛选 2
2.4功能菌株的鉴定 3
2.5 功能菌株以芘为唯一碳源的生长和降解曲线 3
2.5.1 菌体收集 3
2.5.2 含芘培养基的制备 3
2.5.3 芘环境下生长曲线的测定 3
2.5.4 芘降解曲线的测定 3
2.6功能菌株Pyr9gfp在植物根表的定殖及其对植物吸收积累芘的影响 3
2.6.1 功能菌株Pyr9的gfp基因标记 3
2.6.2 盆栽实验 4
2.6.3 菌株Pyr9gfp在植物根表的定殖检测 4
2.6.4 菌株Pyr9gfp定殖植物体数量的检测 4
2.6.5 植物及土壤样品中芘的测定 4
2.7 数据处理 4
3 结果与分析 4
3.1 功能菌株的分离筛选及鉴定 4
3.2 功能菌株的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
芘降解曲线 5
3.3 功能菌株Pyr9gfp的定殖和分布 6
3.4 功能菌株Pyr9gfp的定殖对植物生长的影响 6
3.5 功能菌株Pyr9gfp的定殖对植物吸收芘的影响 6
3.6 功能菌株Pyr9gfp的定殖对土壤中芘的去除 7
4 结论 8
致谢 8
参考文献 9
一株芘降解根际细菌的筛选及其在植物根表的定殖
对植物吸收芘的影响
引言
1引言
多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是一类数量多、分布广、与人类密切相关的环境致癌物，由两个或两个以上的苯环以线状、角状或簇状排列的稠环化合物（仅由碳和氢组成，不含杂原子），主要来源于人类活动和能源利用中有机物的不完全燃烧或热解[1]。因其特殊的物理化学性质，使该类化合物具有高度的稳定性，难以被降解，在环境中能够广泛分布并持久存在。并且，PAHs会产生“三致效应”（致癌、致畸、致基因突变），通过食物链的传递富集，因此对人类健康构成极大的威胁。研究表明，在人类及动物癌症病变中，PAHs已经是环境致癌化学物质里最大的一类[2]。
研究表明，许多根际细菌能够在植物根表定殖并进入根内作为内生细菌存在。植物与根际细菌组成共生体系，可以强化土壤中PAHs的去除效果；同时，根际菌株在植物根表和体内的定殖有助于加速植物体内的PAHs代谢，从而减低植物PAHs污染风险。Sun等分离到一株具有菲降解功能的Pseudomonas sp. Ph6，用gfp基因对其进行了标记，将标记菌株定殖在植物根部，通过测定植物组织菲含量、积累量和传导系数发现该菌可在植物体内定殖并可降低植物的PAHs污染风险[3]。
本研究从PAHs污染区健康植物根表分离筛选到一株可高效降解芘的细菌，该菌株能够以芘为唯一碳源生长并对其进行降解。进一步对其进行gfp基因标记并定殖到植物根表，研究了菌株在植物根表的定殖对植物吸收积累芘以及根际土壤中芘去除的影响。
2材料与方法
2.1试剂和培养基
芘（Pyrene，纯度≥98%）购自德国Fluka公司。芘的相对分子量202.26，25℃纯水中溶解度为0.12 mgL1，辛醇水分配系数（Log Kow）为4.88。甲醇为色谱纯，其它试剂为分析纯。
（1）无机盐培养基（MSM）：NH4NO3 1.50 gL1；K2HPO43H2O 1.91 gL1；KH2PO4 0.50 gL1；NaCl 0.50 gL1；MgSO47H2O 0.20 gL1；（最后加）蒸馏水1000 mL；pH至7.2 ~ 7.4；121℃高压蒸汽灭菌20 min。
（2）含芘的双层固体平板：
下层的制备：向培养皿中倒入灭菌的无机盐固体培养基约15mL，静置凝固。
上层的制备：向灭菌的无机盐固体（含琼脂20 gL1）培养基中加入2 mL芘的丙酮溶液（10 mgmL1），得到芘浓度为0.2 gL1的乳浊状液体。最后趁热倾入3~4 mL乳浊液至已凝固的无机盐固体平板中，轻轻摇匀，使其铺平，静置凝固。
（3）R2A培养基（gL1）：实验室购买3.2 gL1的R2A培养基。若制备固体培养基，则向上述液体培养基中加入20 gL1的琼脂。灭菌条件：温度121°C，时间20 min。
（4）芘降解培养基：配置1000 mgL1的芘母液，取1 mL置于灭菌的三角瓶中，待丙酮挥发完全后加入20 mL灭菌的无机盐培养基，使芘的最终浓度达到50 ppm。
2.2 植物样品采集
采集自南京某石化厂排污口附近的植株牛筋草(Eleusine indica (L.) Gaertn.)
2.3 功能菌株的分离筛选
消毒之后，植物用自来水冲洗干净后，超净台内用75 %酒精漂洗3~5 min，无菌水冲洗3~4次，0.1% HgCl2溶液漂洗2~5 min，无菌水再冲洗数次，将经表面消毒的植物样品移入LB固体平板上、30℃培养后，检查平板上是否有细菌生长。将经检验消毒完全的植株移入无菌研钵，用灭菌剪刀剪碎后，加无菌水充分研磨，取上清液梯度稀释涂布于50 mgL1芘降解固体培养基平板上，30℃培养5 d、待菌落长出，利用平板划线分离纯化至单菌落。
挑取单菌落划线于500 mgL1芘降解菌筛选固体培养基上，30℃培养5 d，观察菌株能否生长并产生水解圈。挑选能在芘筛选固体培养基上生长良好且产水解圈的菌株。
2.4 功能菌株的鉴定
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract. 1
Key words 1
1引言 2
2材料与方法 2
2.1试剂和培养基 2
2.2 植物样品采集 2
2.3 功能菌株的分离筛选 2
2.4功能菌株的鉴定 3
2.5 功能菌株以芘为唯一碳源的生长和降解曲线 3
2.5.1 菌体收集 3
2.5.2 含芘培养基的制备 3
2.5.3 芘环境下生长曲线的测定 3
2.5.4 芘降解曲线的测定 3
2.6功能菌株Pyr9gfp在植物根表的定殖及其对植物吸收积累芘的影响 3
2.6.1 功能菌株Pyr9的gfp基因标记 3
2.6.2 盆栽实验 4
2.6.3 菌株Pyr9gfp在植物根表的定殖检测 4
2.6.4 菌株Pyr9gfp定殖植物体数量的检测 4
2.6.5 植物及土壤样品中芘的测定 4
2.7 数据处理 4
3 结果与分析 4
3.1 功能菌株的分离筛选及鉴定 4
3.2 功能菌株的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
芘降解曲线 5
3.3 功能菌株Pyr9gfp的定殖和分布 6
3.4 功能菌株Pyr9gfp的定殖对植物生长的影响 6
3.5 功能菌株Pyr9gfp的定殖对植物吸收芘的影响 6
3.6 功能菌株Pyr9gfp的定殖对土壤中芘的去除 7
4 结论 8
致谢 8
参考文献 9
一株芘降解根际细菌的筛选及其在植物根表的定殖
对植物吸收芘的影响
引言
1引言
多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是一类数量多、分布广、与人类密切相关的环境致癌物，由两个或两个以上的苯环以线状、角状或簇状排列的稠环化合物（仅由碳和氢组成，不含杂原子），主要来源于人类活动和能源利用中有机物的不完全燃烧或热解[1]。因其特殊的物理化学性质，使该类化合物具有高度的稳定性，难以被降解，在环境中能够广泛分布并持久存在。并且，PAHs会产生“三致效应”（致癌、致畸、致基因突变），通过食物链的传递富集，因此对人类健康构成极大的威胁。研究表明，在人类及动物癌症病变中，PAHs已经是环境致癌化学物质里最大的一类[2]。
研究表明，许多根际细菌能够在植物根表定殖并进入根内作为内生细菌存在。植物与根际细菌组成共生体系，可以强化土壤中PAHs的去除效果；同时，根际菌株在植物根表和体内的定殖有助于加速植物体内的PAHs代谢，从而减低植物PAHs污染风险。Sun等分离到一株具有菲降解功能的Pseudomonas sp. Ph6，用gfp基因对其进行了标记，将标记菌株定殖在植物根部，通过测定植物组织菲含量、积累量和传导系数发现该菌可在植物体内定殖并可降低植物的PAHs污染风险[3]。
本研究从PAHs污染区健康植物根表分离筛选到一株可高效降解芘的细菌，该菌株能够以芘为唯一碳源生长并对其进行降解。进一步对其进行gfp基因标记并定殖到植物根表，研究了菌株在植物根表的定殖对植物吸收积累芘以及根际土壤中芘去除的影响。
2材料与方法
2.1试剂和培养基
芘（Pyrene，纯度≥98%）购自德国Fluka公司。芘的相对分子量202.26，25℃纯水中溶解度为0.12 mgL1，辛醇水分配系数（Log Kow）为4.88。甲醇为色谱纯，其它试剂为分析纯。
（1）无机盐培养基（MSM）：NH4NO3 1.50 gL1；K2HPO43H2O 1.91 gL1；KH2PO4 0.50 gL1；NaCl 0.50 gL1；MgSO47H2O 0.20 gL1；（最后加）蒸馏水1000 mL；pH至7.2 ~ 7.4；121℃高压蒸汽灭菌20 min。
（2）含芘的双层固体平板：
下层的制备：向培养皿中倒入灭菌的无机盐固体培养基约15mL，静置凝固。
上层的制备：向灭菌的无机盐固体（含琼脂20 gL1）培养基中加入2 mL芘的丙酮溶液（10 mgmL1），得到芘浓度为0.2 gL1的乳浊状液体。最后趁热倾入3~4 mL乳浊液至已凝固的无机盐固体平板中，轻轻摇匀，使其铺平，静置凝固。
（3）R2A培养基（gL1）：实验室购买3.2 gL1的R2A培养基。若制备固体培养基，则向上述液体培养基中加入20 gL1的琼脂。灭菌条件：温度121°C，时间20 min。
（4）芘降解培养基：配置1000 mgL1的芘母液，取1 mL置于灭菌的三角瓶中，待丙酮挥发完全后加入20 mL灭菌的无机盐培养基，使芘的最终浓度达到50 ppm。
2.2 植物样品采集
采集自南京某石化厂排污口附近的植株牛筋草(Eleusine indica (L.) Gaertn.)
2.3 功能菌株的分离筛选
消毒之后，植物用自来水冲洗干净后，超净台内用75 %酒精漂洗3~5 min，无菌水冲洗3~4次，0.1% HgCl2溶液漂洗2~5 min，无菌水再冲洗数次，将经表面消毒的植物样品移入LB固体平板上、30℃培养后，检查平板上是否有细菌生长。将经检验消毒完全的植株移入无菌研钵，用灭菌剪刀剪碎后，加无菌水充分研磨，取上清液梯度稀释涂布于50 mgL1芘降解固体培养基平板上，30℃培养5 d、待菌落长出，利用平板划线分离纯化至单菌落。
挑取单菌落划线于500 mgL1芘降解菌筛选固体培养基上，30℃培养5 d，观察菌株能否生长并产生水解圈。挑选能在芘筛选固体培养基上生长良好且产水解圈的菌株。
2.4 功能菌株的鉴定
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