醚苯磺隆降解菌分离鉴定与降解特性研究
摘要：醚苯磺隆属于磺酰脲类除草剂，是目前世界上使用量最大的除草剂之一，具有高效性、杀草谱广、价格低廉等特点，但易通过地表、地下径流从土壤转移到水体。同时，其残留问题会造成农业巨大的损失。本实验从生产醚苯磺隆的农药厂废水处理池的活性污泥中，富集、分离、纯化得到一株能够降解醚苯磺隆的菌株MB-1。经形态观察、生理生化测定和16s rDNA序列分析，该菌株被鉴定为铜绿假单胞菌。从pH、醚苯磺隆初始浓度、接菌量、氯化钠浓度对菌株降解醚苯磺隆的性能进行研究，实验结果表明：该菌株降解醚苯磺隆的适宜pH为6.0，醚苯磺隆初始浓度为200mg/L，接菌量为1%，氯化钠浓度为1g/L。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 实验所需材料 2
1.1.1 实验样品原料2
1.1.2 培养基2
1.1.3 储备液3
1.1.4 实验器材3
1.2 降解菌株的富集、分离与纯化 3
1.3 菌株种子液的制备 3
1.4 醚苯磺隆降解菌的分离鉴定 4
1.4.1 降解菌株的培养鉴定及生理生化鉴定4
1.4.2 降解菌株的16s rDNA基因序列分析4
1.5 菌株生长曲线的测定 4
1.6 菌株降解性能的测定 4
1.6.1 菌株降解曲线的测定4
1.6.2 pH值对菌株降解醚苯磺隆的影响研究5
1.6.3 醚苯磺隆初始浓度对菌株降解醚苯磺隆的影响研究5
1.6.4 接菌量对菌株降解醚苯磺隆的影响研究5
1.6.5 氯化钠浓度对菌株降解醚苯磺隆的影响研究5
1.7 醚苯磺隆含量测定 5
2 结果与分析5
2.1 醚苯磺隆降解菌的筛选结果5
2.2 醚苯磺隆降解菌的分类鉴定5
2.2.1 形态特征5
2.2.2 醚苯磺隆降解菌株的16s rDNA基因序列6
2.3 降解菌株的生长曲线6
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
2.4 降解菌株的降解曲线7
2.5 pH值对菌株降解醚苯磺隆的影响7
2.6 醚苯磺隆初始浓度对菌株降解醚苯磺隆的影响8
2.7 接菌量对菌株降解醚苯磺隆的影响8
2.8 氯化钠浓度对菌株降解醚苯磺隆的影响9
3 讨论 9
致谢10
参考文献11
附录 16s rDNA基因序列12
醚苯磺隆降解菌分离鉴定与降解特性研究
引言
引言
近年来，由于随着时代的变迁食品安全频繁出现问题，例如奶粉中添加三聚氰胺、快餐中添加苏丹红等等，食品健康问题开始得到人们的大力关注。引发我国食品安全问题的主要原因包括农药残余、天然毒素产生的化学性污染以及食品添加剂的滥用[1]。我国人口众多，需要的粮食产量极大，为提高粮食产量无法避免地会施用一定量的农药。在农、牧、林业中用来消灭、预防和控制病虫害的混合物或制剂被称为农药[2]。农药在控制作物的病虫害、提高粮食产量和质量、保证农产品的增收等方面起到了极其关键的作用。农药的种类繁多，根据不同的作用对象可分为除草剂、杀虫剂、杀鼠剂等，根据其功能的不同引申出了植物生长调节剂等。随着科学研究的发展，农药的品种日益繁多。虽然农药的残留会造成环境的污染，但它存在高效性、简便性以及能够快速杀灭害虫等优良特性，这些特性是人们依然大量施用农药的原因，而且随着动植物对农药抗药性的增强，农药的施用量更是大幅度的增加[4]。从国家统计局的统计结果来看，我国的农药年产量已经突破了200万吨的大关，农药的产和施用均位列世界榜首[5]。农药的施用提高了粮食的产量，带动了经济的发展，但同时由于人们过度依赖农药导致的农药滥用行为也留下了严重的残留问题，引发了严重的环境污染。
磺酰脲类除草剂是目前世界上使用量最大的除草剂之一，具有杀草谱广泛、超高效性、高选择性、可混性强、价格低廉等优良特点[6]。上世纪70年代末，美国杜邦公司Levitt等[7]首先开发和报道了磺酰脲类除草剂氯磺隆的除草活性，80年代初，人们开始对这类除草剂进行大规模的商业化生产[24]。至此，大量磺酰脲类除草剂新品被不断地研制与开发。随着大量存在环境问题的除草剂的市场占有率的下降，磺酰脲类除草剂更是引人注目，发展态势蒸蒸日上。1987年我国开始着手研究磺酰脲类除草剂，1993年后我国开始大面积的使用磺酰脲类除草剂。目前我国应用的磺酰脲类除草剂主要包括苄嘧磺隆、砒嘧横隆、磺酰磺隆、甲磺隆、氯嘧磺隆、醚苯磺隆等,对大多数阔叶杂草能够起到防治作用，并且在一定程度上能抑制禾本科杂草的生长[810]。磺酰脲类除草剂由于存在不易光解、不易挥发、残留期较长等特点，易对后茬敏感作物（甜菜、马铃薯、瓜类、高粱、油菜等）造成伤害[11]。另一方面，磺酰脲类除草剂属于乙酰乳酸合成酶（ALS）抑制剂，其作用靶标仅为ALS，由于其作用靶标单一，在大量的重复使用以后，杂草对该类除草剂的抗药性也显著增强，造成了杂草，尤其是多年生的杂草，如问荆、苣荬菜、刺儿菜等难以防除的结果，这些都给农业生产带来了严重后果[24]。例如1994年上半年江苏、安徽两省在油菜田中盲目地施用胺苯磺隆，胺苯磺隆为长残效除草剂，其在土壤中的残留造成下茬农作物水稻受药害达660hm2以上，这一行为的直接后果是造成3万户农民在一季中的损失高达600万元以上。
醚苯磺隆属于磺酰脲类除草剂，在农业的发展中起着重要的推动作用，它主要用于禾谷类田的茎叶处理，对许多阔叶杂草具有芽前或芽后除草活性[12]。醚苯磺隆可通过农田地表径流、农田排水和地下渗透进入附近水体，引起水体污染进而导致农业面源污染[13]。因此，目前对于如何减弱醚苯磺隆对环境的污染作用得到了科学研究者的高度重视。但是在现阶段，前人的研究主要集中于如何测量醚苯磺隆，而对于醚苯磺隆的微生物降解鲜有研究。而微生物降解醚苯磺隆相比于光降解、氧化降解和水解等非生物降解方法，条件简便易操作、控制率高、成本低、专一性强、二次污染程度轻，是目前最为经济有效的方法。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 实验样品原料
本实验样品原料采自某生产醚苯磺隆农药厂的废水处理池。
1．1．2 培养基
用去离子水将培养基补足至1000 mL，pH 7.0~7.2。121℃下高压灭菌20分钟。将2%的琼脂添加到上述无机盐、LB液体培养基中，待灭菌冷却后即为固体培养基。
1．1．3 储备液
用乙腈(色谱纯)将0.40g醚苯磺隆原药溶解后转入100 mL容量瓶中，在超声仪中超声15 min后冷却至室温，将储备液用乙腈补足至100ml，混合均匀。将制成的4000 mg / L的醚苯磺隆储备液经0.45μm 有机滤膜过滤后转入试剂瓶中密封保存。
1．1．4 实验器材
实验所需器材主要如下表所示：
表11 实验器材表
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 实验所需材料 2
1.1.1 实验样品原料2
1.1.2 培养基2
1.1.3 储备液3
1.1.4 实验器材3
1.2 降解菌株的富集、分离与纯化 3
1.3 菌株种子液的制备 3
1.4 醚苯磺隆降解菌的分离鉴定 4
1.4.1 降解菌株的培养鉴定及生理生化鉴定4
1.4.2 降解菌株的16s rDNA基因序列分析4
1.5 菌株生长曲线的测定 4
1.6 菌株降解性能的测定 4
1.6.1 菌株降解曲线的测定4
1.6.2 pH值对菌株降解醚苯磺隆的影响研究5
1.6.3 醚苯磺隆初始浓度对菌株降解醚苯磺隆的影响研究5
1.6.4 接菌量对菌株降解醚苯磺隆的影响研究5
1.6.5 氯化钠浓度对菌株降解醚苯磺隆的影响研究5
1.7 醚苯磺隆含量测定 5
2 结果与分析5
2.1 醚苯磺隆降解菌的筛选结果5
2.2 醚苯磺隆降解菌的分类鉴定5
2.2.1 形态特征5
2.2.2 醚苯磺隆降解菌株的16s rDNA基因序列6
2.3 降解菌株的生长曲线6
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
2.4 降解菌株的降解曲线7
2.5 pH值对菌株降解醚苯磺隆的影响7
2.6 醚苯磺隆初始浓度对菌株降解醚苯磺隆的影响8
2.7 接菌量对菌株降解醚苯磺隆的影响8
2.8 氯化钠浓度对菌株降解醚苯磺隆的影响9
3 讨论 9
致谢10
参考文献11
附录 16s rDNA基因序列12
醚苯磺隆降解菌分离鉴定与降解特性研究
引言
引言
近年来，由于随着时代的变迁食品安全频繁出现问题，例如奶粉中添加三聚氰胺、快餐中添加苏丹红等等，食品健康问题开始得到人们的大力关注。引发我国食品安全问题的主要原因包括农药残余、天然毒素产生的化学性污染以及食品添加剂的滥用[1]。我国人口众多，需要的粮食产量极大，为提高粮食产量无法避免地会施用一定量的农药。在农、牧、林业中用来消灭、预防和控制病虫害的混合物或制剂被称为农药[2]。农药在控制作物的病虫害、提高粮食产量和质量、保证农产品的增收等方面起到了极其关键的作用。农药的种类繁多，根据不同的作用对象可分为除草剂、杀虫剂、杀鼠剂等，根据其功能的不同引申出了植物生长调节剂等。随着科学研究的发展，农药的品种日益繁多。虽然农药的残留会造成环境的污染，但它存在高效性、简便性以及能够快速杀灭害虫等优良特性，这些特性是人们依然大量施用农药的原因，而且随着动植物对农药抗药性的增强，农药的施用量更是大幅度的增加[4]。从国家统计局的统计结果来看，我国的农药年产量已经突破了200万吨的大关，农药的产和施用均位列世界榜首[5]。农药的施用提高了粮食的产量，带动了经济的发展，但同时由于人们过度依赖农药导致的农药滥用行为也留下了严重的残留问题，引发了严重的环境污染。
磺酰脲类除草剂是目前世界上使用量最大的除草剂之一，具有杀草谱广泛、超高效性、高选择性、可混性强、价格低廉等优良特点[6]。上世纪70年代末，美国杜邦公司Levitt等[7]首先开发和报道了磺酰脲类除草剂氯磺隆的除草活性，80年代初，人们开始对这类除草剂进行大规模的商业化生产[24]。至此，大量磺酰脲类除草剂新品被不断地研制与开发。随着大量存在环境问题的除草剂的市场占有率的下降，磺酰脲类除草剂更是引人注目，发展态势蒸蒸日上。1987年我国开始着手研究磺酰脲类除草剂，1993年后我国开始大面积的使用磺酰脲类除草剂。目前我国应用的磺酰脲类除草剂主要包括苄嘧磺隆、砒嘧横隆、磺酰磺隆、甲磺隆、氯嘧磺隆、醚苯磺隆等,对大多数阔叶杂草能够起到防治作用，并且在一定程度上能抑制禾本科杂草的生长[810]。磺酰脲类除草剂由于存在不易光解、不易挥发、残留期较长等特点，易对后茬敏感作物（甜菜、马铃薯、瓜类、高粱、油菜等）造成伤害[11]。另一方面，磺酰脲类除草剂属于乙酰乳酸合成酶（ALS）抑制剂，其作用靶标仅为ALS，由于其作用靶标单一，在大量的重复使用以后，杂草对该类除草剂的抗药性也显著增强，造成了杂草，尤其是多年生的杂草，如问荆、苣荬菜、刺儿菜等难以防除的结果，这些都给农业生产带来了严重后果[24]。例如1994年上半年江苏、安徽两省在油菜田中盲目地施用胺苯磺隆，胺苯磺隆为长残效除草剂，其在土壤中的残留造成下茬农作物水稻受药害达660hm2以上，这一行为的直接后果是造成3万户农民在一季中的损失高达600万元以上。
醚苯磺隆属于磺酰脲类除草剂，在农业的发展中起着重要的推动作用，它主要用于禾谷类田的茎叶处理，对许多阔叶杂草具有芽前或芽后除草活性[12]。醚苯磺隆可通过农田地表径流、农田排水和地下渗透进入附近水体，引起水体污染进而导致农业面源污染[13]。因此，目前对于如何减弱醚苯磺隆对环境的污染作用得到了科学研究者的高度重视。但是在现阶段，前人的研究主要集中于如何测量醚苯磺隆，而对于醚苯磺隆的微生物降解鲜有研究。而微生物降解醚苯磺隆相比于光降解、氧化降解和水解等非生物降解方法，条件简便易操作、控制率高、成本低、专一性强、二次污染程度轻，是目前最为经济有效的方法。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 实验样品原料
本实验样品原料采自某生产醚苯磺隆农药厂的废水处理池。
1．1．2 培养基
用去离子水将培养基补足至1000 mL，pH 7.0~7.2。121℃下高压灭菌20分钟。将2%的琼脂添加到上述无机盐、LB液体培养基中，待灭菌冷却后即为固体培养基。
1．1．3 储备液
用乙腈(色谱纯)将0.40g醚苯磺隆原药溶解后转入100 mL容量瓶中，在超声仪中超声15 min后冷却至室温，将储备液用乙腈补足至100ml，混合均匀。将制成的4000 mg / L的醚苯磺隆储备液经0.45μm 有机滤膜过滤后转入试剂瓶中密封保存。
1．1．4 实验器材
实验所需器材主要如下表所示：
表11 实验器材表
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