定殖对植物体内多环芳烃含量及酶活的影响
摘要：从植物体内筛选具有多环芳烃(PAHs) 降解功能的内生细菌并定殖于植物体，有望有效地去除植物体内PAHs，从而减低植物污染风险。基于此研究目的本实验采用小麦水培试验方法，利用降解菌株PW7进行定殖研究，采用适合于植物修复的浸种的方法进行接种并将小麦于含有芘污染的霍格兰营养液中培养，待小麦培养4天及8天，分别进行植物体内芘的提取与测定、培养液中芘的提取与测定及酶活力的测定。实验数据表明，与空白对照组相比，浸种处理组的小麦鲜重和干重均有所增加，植物体内芘含量和积累量显著降低且茎叶中含量总是小于根中含量，邻苯二酚2,3双加氧酶的活性增大。由此得出结论，接种功能细菌可以减低植物中芘的浓度、积累量和转运能力，促进植物生长及邻苯二酚2, 3双加氧酶的表达。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言： 1
1 材料与方法 2
1.1 试验材料 2
1.1.1 实验试剂 2
1.1.2 培养基 2
1.2 试验方法 3
1.2.1小麦水培试验 3
1.2.1.1降解菌株抗性标记 3
1.2.1.2内生细菌在小麦种的定殖 3
1.2.1.3芘污染营养液配置及小麦培养 3
1.2.2培养液中芘的提取与测定 3
1.2.3植物体内芘的提取与测定 3
1.2.4 邻苯二酚2,3双加氧酶的提取与测定 4
2 结果与分析 4
2.1菌株PW7对小麦生长的影响 4
2.2培养液中芘的去除 4
2.3植物体内芘含量 5
2.4植物体内芘的积累量 6
2.5邻苯二酚2,3双加氧酶活力测定 7
3 讨论 8
4 结论 8
致谢 9
参考文献 10
定殖对植物体内多环芳烃含量及酶活的影响
引言
土壤有机污染引起的植物污染风险已成为国际关注的热点问题之一[12]。多环芳烃(PAHs) 是土壤污染中广泛存在的有机污染物，具有致癌、致畸、致突
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
变作用，能通过食物链富集进而威胁人群健康[35]。芘是由四个苯环对称排列组成的稠环芳烃，结构稳定，是PAHs中一种典型的难降解高分子量代表化合物，被作为监测PAHs污染的指示物和其它PAHs光化学降解、生物降解的模型分子之一[67]。
植物内生细菌是指能够定殖在植物健康组织间隙或细胞内，并与宿主植物建立和谐共生关系的一类微生物[8] 。研究发现，植物内生细菌在植物体内生长繁殖过程中可产生生长素、酶类等次生代谢产物，影响植物体内的激素水平，从而调节植物代谢，促进植物生长，提高植物耐受性[911]。本实验采用降解菌株Serratia sp.PW7作为供试菌株，将该菌在小麦体内定殖，探讨其对一定浓度芘的降解效果以及对小麦生长的影响。
芘作为四环多环芳烃降解的模式化合物能够被一些细菌和真菌完全矿化为二氧化 碳和水，这一途径通常是通过起始双氧酶(细菌中)和单加氧酶(细菌和真菌中)的加氧开 环反应开始的，而芘的降解通常是通过双加氧酶途径完成的[12]。在多环芳烃的降解过程中，实际上是一系列酶按一定秩序发挥着催化作用的结果，因此，降解的过程与酶有着非常重要的关联。本实验则通过对邻苯二酚2,3双加氧酶的测定探讨芘的降解效率。邻苯酚2,3双加氧酶是多环芳烃等芳香烃类污染物降解的重要酶类。邻苯二酚是多环芳烃降解的代谢中间物，也叫变儿茶酚酶( M P C )，能够催化苯环的邻位裂解，将无色或棕色的邻苯二酚转变为黄色的2 羟粘糠酸半醛 (H M S)[1314]。邻苯二酚2,3双加氧酶可催化邻苯二酚在两个酚羟基的邻位开环，其产物是粘糠半醛。邻苯二酚2,3双加氧酶是典型的邻位氧化开环酶，所以也称作外二元醇双加氧酶[15] 。
材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 实验试剂
化学试剂：芘(Pyrene)购自德国Fluka公司，纯度＞98%。甲醇为色谱醇，其它试剂为分析纯。
供试植物：小麦(wheat)，品种为扬麦16。
供试菌株：降解菌株Serratia sp.PW7。产红色素，对氨苄青霉素、盐酸四环素、链霉素、卡那霉素、大观霉素等均有抗性。底物为50mgL1时降解率最高，达到了47%以上。
霍格兰营养液(Hoagland nutrient solution)：Ca(NO3)24H2O 945 mgL–1，KNO3 506 mgL–1，MgSO4 493 mgL–1，KH2PO4 136 mgL–1，NH4NO3 80 mgL–1，pH 5.5；铁盐溶液(2.5 mL)：FeSO47H2O 2.78 g，EDTANa2 3.73 g，蒸馏水500 mL；微量元素溶液(5 mL)：MnSO4 22.3 mgL–1，ZnSO4 8.6 mgL–1，H3BO3 6.2 mgL–1，KI 0.83 mgL–1，Na2MoO4 0.25 mgL–1，CuSO4 0.025 mgL–1，CoCl2 0.025 mgL–1， pH 6.0。
磷酸盐缓冲液（PBS）：K2HPO4H2O 21.75 gL1，Na2HPO412H2O 33.4 gL1，KH2PO4 48.7 gL1，NH4Cl 5.2 gL1。121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
1.1.2 培养基
LB培养基：蛋白胨10.0 gL1，酵母粉5.0 gL1，NaCl 10.0 gL1，pH 7.0。
无机盐培养基(MSM)：(NH4)2SO4 1.50 g?L1，K2HPO4?3H2O 1.91 g?L1，KH2PO4 0.50 g?L1，MgSO4?7H2O 0.20 g?L1，2 mL微量元素溶液(CoCl2?6H2O 0.1 mg?L1，MnCl2?4H2O 0.425 mg?L1，ZnCl2 0.05 mg?L1，NiCl2?6H2O 0.01 mg?L1，CuSO4?5H2O 0.015 mg?L1，Na2MoO4?2H2O 0.01 mg?L1，Na2SeO4?2H2O 0.01 mg?L1)，pH 7.0。固体培养基加2.0%琼脂。
LB抗性培养基：向LB培养基中（约60℃时）加入三种抗生素（氨苄青霉素、链霉素、盐酸四环素），使三种抗生素的最终浓度分别达到实验设计浓度。
MSM抗性养基：向芘降解培养基中（约60℃时）加入三种抗生素（氨苄青霉素、链霉素、盐酸四环素），使三种抗生素的终浓度分别为100 mgL1。
1.2 试验方法
1.2.1小麦水培试验
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言： 1
1 材料与方法 2
1.1 试验材料 2
1.1.1 实验试剂 2
1.1.2 培养基 2
1.2 试验方法 3
1.2.1小麦水培试验 3
1.2.1.1降解菌株抗性标记 3
1.2.1.2内生细菌在小麦种的定殖 3
1.2.1.3芘污染营养液配置及小麦培养 3
1.2.2培养液中芘的提取与测定 3
1.2.3植物体内芘的提取与测定 3
1.2.4 邻苯二酚2,3双加氧酶的提取与测定 4
2 结果与分析 4
2.1菌株PW7对小麦生长的影响 4
2.2培养液中芘的去除 4
2.3植物体内芘含量 5
2.4植物体内芘的积累量 6
2.5邻苯二酚2,3双加氧酶活力测定 7
3 讨论 8
4 结论 8
致谢 9
参考文献 10
定殖对植物体内多环芳烃含量及酶活的影响
引言
土壤有机污染引起的植物污染风险已成为国际关注的热点问题之一[12]。多环芳烃(PAHs) 是土壤污染中广泛存在的有机污染物，具有致癌、致畸、致突
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
变作用，能通过食物链富集进而威胁人群健康[35]。芘是由四个苯环对称排列组成的稠环芳烃，结构稳定，是PAHs中一种典型的难降解高分子量代表化合物，被作为监测PAHs污染的指示物和其它PAHs光化学降解、生物降解的模型分子之一[67]。
植物内生细菌是指能够定殖在植物健康组织间隙或细胞内，并与宿主植物建立和谐共生关系的一类微生物[8] 。研究发现，植物内生细菌在植物体内生长繁殖过程中可产生生长素、酶类等次生代谢产物，影响植物体内的激素水平，从而调节植物代谢，促进植物生长，提高植物耐受性[911]。本实验采用降解菌株Serratia sp.PW7作为供试菌株，将该菌在小麦体内定殖，探讨其对一定浓度芘的降解效果以及对小麦生长的影响。
芘作为四环多环芳烃降解的模式化合物能够被一些细菌和真菌完全矿化为二氧化 碳和水，这一途径通常是通过起始双氧酶(细菌中)和单加氧酶(细菌和真菌中)的加氧开 环反应开始的，而芘的降解通常是通过双加氧酶途径完成的[12]。在多环芳烃的降解过程中，实际上是一系列酶按一定秩序发挥着催化作用的结果，因此，降解的过程与酶有着非常重要的关联。本实验则通过对邻苯二酚2,3双加氧酶的测定探讨芘的降解效率。邻苯酚2,3双加氧酶是多环芳烃等芳香烃类污染物降解的重要酶类。邻苯二酚是多环芳烃降解的代谢中间物，也叫变儿茶酚酶( M P C )，能够催化苯环的邻位裂解，将无色或棕色的邻苯二酚转变为黄色的2 羟粘糠酸半醛 (H M S)[1314]。邻苯二酚2,3双加氧酶可催化邻苯二酚在两个酚羟基的邻位开环，其产物是粘糠半醛。邻苯二酚2,3双加氧酶是典型的邻位氧化开环酶，所以也称作外二元醇双加氧酶[15] 。
材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 实验试剂
化学试剂：芘(Pyrene)购自德国Fluka公司，纯度＞98%。甲醇为色谱醇，其它试剂为分析纯。
供试植物：小麦(wheat)，品种为扬麦16。
供试菌株：降解菌株Serratia sp.PW7。产红色素，对氨苄青霉素、盐酸四环素、链霉素、卡那霉素、大观霉素等均有抗性。底物为50mgL1时降解率最高，达到了47%以上。
霍格兰营养液(Hoagland nutrient solution)：Ca(NO3)24H2O 945 mgL–1，KNO3 506 mgL–1，MgSO4 493 mgL–1，KH2PO4 136 mgL–1，NH4NO3 80 mgL–1，pH 5.5；铁盐溶液(2.5 mL)：FeSO47H2O 2.78 g，EDTANa2 3.73 g，蒸馏水500 mL；微量元素溶液(5 mL)：MnSO4 22.3 mgL–1，ZnSO4 8.6 mgL–1，H3BO3 6.2 mgL–1，KI 0.83 mgL–1，Na2MoO4 0.25 mgL–1，CuSO4 0.025 mgL–1，CoCl2 0.025 mgL–1， pH 6.0。
磷酸盐缓冲液（PBS）：K2HPO4H2O 21.75 gL1，Na2HPO412H2O 33.4 gL1，KH2PO4 48.7 gL1，NH4Cl 5.2 gL1。121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
1.1.2 培养基
LB培养基：蛋白胨10.0 gL1，酵母粉5.0 gL1，NaCl 10.0 gL1，pH 7.0。
无机盐培养基(MSM)：(NH4)2SO4 1.50 g?L1，K2HPO4?3H2O 1.91 g?L1，KH2PO4 0.50 g?L1，MgSO4?7H2O 0.20 g?L1，2 mL微量元素溶液(CoCl2?6H2O 0.1 mg?L1，MnCl2?4H2O 0.425 mg?L1，ZnCl2 0.05 mg?L1，NiCl2?6H2O 0.01 mg?L1，CuSO4?5H2O 0.015 mg?L1，Na2MoO4?2H2O 0.01 mg?L1，Na2SeO4?2H2O 0.01 mg?L1)，pH 7.0。固体培养基加2.0%琼脂。
LB抗性培养基：向LB培养基中（约60℃时）加入三种抗生素（氨苄青霉素、链霉素、盐酸四环素），使三种抗生素的最终浓度分别达到实验设计浓度。
MSM抗性养基：向芘降解培养基中（约60℃时）加入三种抗生素（氨苄青霉素、链霉素、盐酸四环素），使三种抗生素的终浓度分别为100 mgL1。
1.2 试验方法
1.2.1小麦水培试验
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