溶菌酶功能化金纳米颗粒抑菌性能研究
纳米作为一类新型抑菌原料，是无机超细颗粒，由于其的光学、电学、力学等性质，纳米材料有普通抑菌剂所不具备的优势，作为目前生物学研究的热点。本实验以金纳米颗粒为基础，通过表面定向修饰溶菌酶，制备绿色、高效的溶菌酶功能化金纳米颗粒抑菌材料，通过研究不同比例的金颗粒和溶菌酶混合溶液、单纯金颗粒的不同浓度、单纯的溶菌酶的不同浓度分别对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌抑菌活性、生长曲线的影响，揭示纳米材料抑菌性能。研究发现与未修饰的金及单纯的溶菌酶相比，溶菌酶功能化金颗粒对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌作用均显著加强，表现出协同抑菌作用。在最优条件下，0.1 g/L溶菌酶功能化金纳米颗粒可以100%杀死两种细菌。PI染色结果表明溶菌酶功能化金颗粒主要可以穿透菌体细胞壁、损坏细胞膜的组成，从而杀死细菌。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words2
引言2
1 材料与方法3
1.1 菌种与试剂 种与试剂3
1.2 仪器与设备 3
1.3方法3
1.3.1溶菌酶功能化金纳米颗粒的制备与表征3
1.3.2溶菌酶功能化金纳米颗粒抑菌活性测定3
1.3.3溶菌酶功能化金纳米颗粒最小抑菌浓度（MIC）测定4
1.3.4溶菌酶功能化金纳米颗粒生长抑制曲线测定4
1.3.5活菌/死菌荧光染色分析4
2 结果与分析4
2.1 溶菌酶功能化金纳米颗粒制备与表征4
2.2 溶菌酶功能化金纳米颗粒抑菌活性测定5
2.3 溶菌酶功能化金纳米颗粒最小抑菌浓度（MIC）测定7
2.4 溶菌酶功能化金纳米颗粒生长抑制曲线测定7
2.5 活菌/死菌荧光染色分析8
3 讨论9
4 结论9
致谢9
参考文献9 溶菌酶功能化金纳米颗粒抑菌性能研究
引言
引言
溶菌酶是一种天然成分，考虑到它的绿色环保，一般情况下较稳定，耐热，所以是一种应用较多的酶。蛋清溶菌酶，顾名思义，是以蛋清为原料，经过一系列处理最后冷冻干燥得到，是已知 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
的最耐热的酶。
溶菌酶的作用机理主要是破坏细菌细胞壁的两种组成氨基糖之间的糖苷键，即把肽聚糖形成的多糖支架分解，让细胞壁不再坚固，不溶性物质变为可溶性物质，从而细胞壁承受不住而裂开，细菌的内容物溢出，直接造成死亡。溶菌酶除了造成细菌死亡还可以导致病毒失活。因此，溶菌酶在医疗方面有抗菌消炎等功效。
如今，常用的抗生素对细菌的抑制作用越来越弱，细菌有了抗药性，因此人们把眼光转向了纳米材料。纳米材料肉眼难以观察，尺寸大概在1～100 nm间，处在原子和宏观物体的过渡地段，纳米材料是介观系统。纳米材料是近年来发展的新型材料，因为它既有一般宏观物质的特性，又有一些微观粒子所具有的特性，特别是在光学、化学、催化等方面的性质受到人们极大的关注，因此应用比较广泛。纳米材料主要通过离子交换[1]、物理吸附、多层包覆等不一样的技术方法来抑制细菌生长活力，通过类似溶菌酶的天然成分与无机抗菌成分结合，制得具有快速高效抑菌能力的溶液。一般的无机纳米材料的抑菌成分为金、银、锌等。
纳米材料具有小尺寸效应、极大的比表面积、量子尺寸效应等多种性能，因而有传统抑菌剂不可比较的抑菌性能[2] 。据研究，Ag由于在杀菌方面效果强大、速度快和强渗透力等优点，而且Ag抗菌范围广，常被用在生物、医疗等领域，但有研究发现Ag对哺乳动物细胞有较大的毒性[3]。金纳米颗粒具有优良的生物相容性、稳定的生化性能、可控的形貌、易于润色等功能，当前已经在成像、癌症治疗、生物传感等方面应用较多。有学者研究发现，金纳米颗粒之所以能够杀死细菌，是因为可以把细胞膜通透性破坏，从而内容物泄露使菌体死亡，金纳米颗粒对G+（革兰氏阳性菌）和G（革兰氏阴性菌）有不一样的抑菌作用，而且不会产生耐药性。但是单独使用金纳米颗粒往往实际杀菌的效果并不是特别好[4]。
纳米材料和常规大尺寸材料不一样，它的性质受纳米材料本身的尺寸、形貌、表面性质、聚集状态、剂量等因素影响很大，金纳米颗粒通过静电吸附作用将修饰物质吸附到其表面，从而制备合成具有不同表面性能的功能性金纳米颗粒[5]。此外，对金纳米颗粒进行表面定向修饰，它的细胞毒性可以有效降低，正因为这个性质，功能化金纳米颗粒已被广泛用于药物释放、光学成像和光热治疗等方面，是目前纳米材料领域研究的热点[6]。近期研究发现，想要提高纳米材料的抑菌性能，有效的抑制微生物的生长，可以把抗生素、溶菌酶等小分子定向修饰在纳米材料表面[7]。
本实验为了解决这两种材料在抑菌方面的局限性，综合纳米材料与溶菌酶的优点，研究出环保、高效率、广谱的抑菌材料，通过制备这种溶菌酶功能化金纳米颗粒的抑菌材料，研究这种复合材料对这两种不同菌种的抗菌性能及抗菌的时效性。
1 材料与方法
1.1 菌种与试剂
金黄色葡萄球菌(S.aureus CMCC(B)26003)、大肠杆菌(E. coli ATCC25922) 广东环凯微生物科技有限公司；普通肉汤培养基、伊红美兰固体培养基、贝尔德帕克固体培养基 青岛海博生物科技有限公司；氯金酸 北京化学试剂公司；柠檬酸三钠 美国Sigma公司；单宁酸 上海瑞永生物科技有限公司；碳酸钾 西陇化工股份有限公司；蛋清溶菌酶 Solarbio公司。本实验所用的水都是去离子水，所用的玻璃器皿都先用王水（浓盐酸：浓硝酸体积比为3：1）浸泡后用去离子水清洗，干燥箱中干燥备用。
1.2 仪器与设备
JEM2100透射电子显微镜 日本电子株式会社；UV2600紫外可见光分光光度计 岛津有限公司；Allegra64R台式冷冻离心机 美国Beckman公司； Nano ZS90纳米粒度及Zeta电位仪 英国马尔文仪器有限公司；SWCJIFD型单人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司；BrukerM90电感耦合等离子体质谱仪 布鲁克科技有限公司；TCSSP2激光共聚焦显微镜 德国Leica公司。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words2
引言2
1 材料与方法3
1.1 菌种与试剂 种与试剂3
1.2 仪器与设备 3
1.3方法3
1.3.1溶菌酶功能化金纳米颗粒的制备与表征3
1.3.2溶菌酶功能化金纳米颗粒抑菌活性测定3
1.3.3溶菌酶功能化金纳米颗粒最小抑菌浓度（MIC）测定4
1.3.4溶菌酶功能化金纳米颗粒生长抑制曲线测定4
1.3.5活菌/死菌荧光染色分析4
2 结果与分析4
2.1 溶菌酶功能化金纳米颗粒制备与表征4
2.2 溶菌酶功能化金纳米颗粒抑菌活性测定5
2.3 溶菌酶功能化金纳米颗粒最小抑菌浓度（MIC）测定7
2.4 溶菌酶功能化金纳米颗粒生长抑制曲线测定7
2.5 活菌/死菌荧光染色分析8
3 讨论9
4 结论9
致谢9
参考文献9 溶菌酶功能化金纳米颗粒抑菌性能研究
引言
引言
溶菌酶是一种天然成分，考虑到它的绿色环保，一般情况下较稳定，耐热，所以是一种应用较多的酶。蛋清溶菌酶，顾名思义，是以蛋清为原料，经过一系列处理最后冷冻干燥得到，是已知 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
的最耐热的酶。
溶菌酶的作用机理主要是破坏细菌细胞壁的两种组成氨基糖之间的糖苷键，即把肽聚糖形成的多糖支架分解，让细胞壁不再坚固，不溶性物质变为可溶性物质，从而细胞壁承受不住而裂开，细菌的内容物溢出，直接造成死亡。溶菌酶除了造成细菌死亡还可以导致病毒失活。因此，溶菌酶在医疗方面有抗菌消炎等功效。
如今，常用的抗生素对细菌的抑制作用越来越弱，细菌有了抗药性，因此人们把眼光转向了纳米材料。纳米材料肉眼难以观察，尺寸大概在1～100 nm间，处在原子和宏观物体的过渡地段，纳米材料是介观系统。纳米材料是近年来发展的新型材料，因为它既有一般宏观物质的特性，又有一些微观粒子所具有的特性，特别是在光学、化学、催化等方面的性质受到人们极大的关注，因此应用比较广泛。纳米材料主要通过离子交换[1]、物理吸附、多层包覆等不一样的技术方法来抑制细菌生长活力，通过类似溶菌酶的天然成分与无机抗菌成分结合，制得具有快速高效抑菌能力的溶液。一般的无机纳米材料的抑菌成分为金、银、锌等。
纳米材料具有小尺寸效应、极大的比表面积、量子尺寸效应等多种性能，因而有传统抑菌剂不可比较的抑菌性能[2] 。据研究，Ag由于在杀菌方面效果强大、速度快和强渗透力等优点，而且Ag抗菌范围广，常被用在生物、医疗等领域，但有研究发现Ag对哺乳动物细胞有较大的毒性[3]。金纳米颗粒具有优良的生物相容性、稳定的生化性能、可控的形貌、易于润色等功能，当前已经在成像、癌症治疗、生物传感等方面应用较多。有学者研究发现，金纳米颗粒之所以能够杀死细菌，是因为可以把细胞膜通透性破坏，从而内容物泄露使菌体死亡，金纳米颗粒对G+（革兰氏阳性菌）和G（革兰氏阴性菌）有不一样的抑菌作用，而且不会产生耐药性。但是单独使用金纳米颗粒往往实际杀菌的效果并不是特别好[4]。
纳米材料和常规大尺寸材料不一样，它的性质受纳米材料本身的尺寸、形貌、表面性质、聚集状态、剂量等因素影响很大，金纳米颗粒通过静电吸附作用将修饰物质吸附到其表面，从而制备合成具有不同表面性能的功能性金纳米颗粒[5]。此外，对金纳米颗粒进行表面定向修饰，它的细胞毒性可以有效降低，正因为这个性质，功能化金纳米颗粒已被广泛用于药物释放、光学成像和光热治疗等方面，是目前纳米材料领域研究的热点[6]。近期研究发现，想要提高纳米材料的抑菌性能，有效的抑制微生物的生长，可以把抗生素、溶菌酶等小分子定向修饰在纳米材料表面[7]。
本实验为了解决这两种材料在抑菌方面的局限性，综合纳米材料与溶菌酶的优点，研究出环保、高效率、广谱的抑菌材料，通过制备这种溶菌酶功能化金纳米颗粒的抑菌材料，研究这种复合材料对这两种不同菌种的抗菌性能及抗菌的时效性。
1 材料与方法
1.1 菌种与试剂
金黄色葡萄球菌(S.aureus CMCC(B)26003)、大肠杆菌(E. coli ATCC25922) 广东环凯微生物科技有限公司；普通肉汤培养基、伊红美兰固体培养基、贝尔德帕克固体培养基 青岛海博生物科技有限公司；氯金酸 北京化学试剂公司；柠檬酸三钠 美国Sigma公司；单宁酸 上海瑞永生物科技有限公司；碳酸钾 西陇化工股份有限公司；蛋清溶菌酶 Solarbio公司。本实验所用的水都是去离子水，所用的玻璃器皿都先用王水（浓盐酸：浓硝酸体积比为3：1）浸泡后用去离子水清洗，干燥箱中干燥备用。
1.2 仪器与设备
JEM2100透射电子显微镜 日本电子株式会社；UV2600紫外可见光分光光度计 岛津有限公司；Allegra64R台式冷冻离心机 美国Beckman公司； Nano ZS90纳米粒度及Zeta电位仪 英国马尔文仪器有限公司；SWCJIFD型单人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司；BrukerM90电感耦合等离子体质谱仪 布鲁克科技有限公司；TCSSP2激光共聚焦显微镜 德国Leica公司。
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