拮抗放线菌筛选半固体发酵及其抗菌活性研究
从草莓植株及草莓根际土壤中分离出2株植物内生放线菌G-1，G-2和4株根际土壤放线菌Wl-1，Wl-2，Wl-4，Wl-5，将6株放线菌分别与4种草莓根腐病病原菌进行对峙培养，实验表明Wl-4菌株对病原菌的抑菌作用最为明显。对放线菌Wl-4菌落观察，菌落圆形，灰白色呈粉状，产生黄色水溶性色素；显微镜观察孢子丝弯曲成波浪形，菌丝纤细，平缓颜色浅。放线菌Wl-4在半固体培养中，28℃，发酵7天，菌数达到2.87×107CFU mL-1，固体制剂浸提液对指示菌有明显的抑制作用。抗性放线菌Wl-4具有潜在的抑制草莓病害作用。
目录
摘要1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言2
1 材料与方法2
1.1 材料2
1.1.1 草莓植株和草莓根际土壤样品 2
1.1.2 草莓根腐病病原菌 2
1.1.3 培养基 2
1.2 方法2
1.2.1 草莓根际土样中放线菌分离 2
1.2.2 草莓内生放线菌的分离 3
1.2.3 抗菌活性测定 3
1.2.4 放线菌W14孢子丝形态观察3
1.2.5 放线菌W14理化特征测定 3
1.2.6 菌株W14种子摇瓶培养 4
1.2.7 菌株W14的半固体发酵 4
1.2.8 菌株W14半固体发酵制剂抑制单细胞真菌活性测定 4
1.2.9 W14半固体发酵制剂中菌体数量测定4
2 结果与分析 4
2.1 放线菌的分离和培养4
2.2 放线菌菌株抑菌活性测定5
2.3 菌株Wl4菌落形态及孢子丝形态观察 6
2.3.1 菌株Wl4菌落形态 6
2.3.2 菌株Wl4孢子丝形态6
2.4 菌株Wl4生理生化特征7
2.5 菌株Wl4摇瓶种子培养及半固体发酵实验 7
2.6 菌株W14半固体发酵制剂抑制酵母菌活性测定 8
2.7 W14半固体发酵制剂数量测定9
3 讨论 10 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
致谢 11
参考文献 12
拮抗放线菌筛选、半固体发酵及其抗菌活性研究
引言
引言
草莓连作障碍在草莓种植区普遍存在，对草莓种植业危害很大，是限制草莓产业发展的瓶颈。目前，生产上防治草莓连作障碍较多采用轮作倒茬、换土、无土栽培、选用抗病品种及溴甲烷化学消毒等方法[1]。但是，这些方法也存在各种问题，如老种植区长期倒茬，现已无地可以轮作；换土工作量大，且生土肥力较低；无土栽培成本高；抗病品种选育的进展不大；溴甲烷等化学产品效果较好，但其毒性大，且会抑制土壤中的其他微生物生长。
生物防治是一种有应用前景的抗植物病害方法，而生物防治对环境中的有益微生物无影响、无残留、无污染、不杀伤天敌、不会(或较少) 产生抗药性等优点，有利于人畜安全及环境保护，其成本低、兼防兼治、增产增收，是一种无公害植保新技术。利用病原菌的拮抗菌进行生物防治，进而控制植物病害的危害是值得深入研究的一条途径。
植物病害生物防治强调的是生态系的良性循环和环境保护，由于其社会效益、生态效益、长远利益而愈来愈引起人们的重视，是符合我国农业生产持久稳定发展要求的长期策略。放线菌作为一种具有丰富资源的微生物类群，在农业植物病害生物防治中很有开发应用前景。
如果能筛选培养出对草莓病原菌有抑制作用的放线菌，就能在一定程度上解决草莓病害对草莓种植的不利影响，从而使草莓产量增长，扩大草莓产业的发展。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1草莓植株和草莓根际土壤样品
采自南京泉水镇、麒麟镇草莓种植大棚，4℃冰箱保存。
1.1.2草莓根腐病病原菌：菌株Y1、Y2、Y3、 Y5，实验室保存。
1.1.3培养基
高氏一号培养基，组分：可溶性淀粉20g、KNO3 1.0g、K2HPO4 0.5g、MgSO47H2O 0.5g、NaCl 0.5g、FeSO47H2O 0.01g、琼脂20g、H2O 1000mL、pH7.2~7.4。
PDA（马铃薯蔗糖琼脂）培养基，组分：马铃薯200g、蔗糖（或葡萄糖）20g、琼脂20g、H2O 1000mL、pH自然。
种子摇瓶培养基，组分：葡萄糖 4.5g，黄豆粉3.0g，酵母粉0.5g，碳酸钙0.5g，pH7.5，水100ml。
半固体发酵培养基，组分：麦麸80 %，玉米粉8 %，小米粉10 %，蛋白胨2 %，CaCO30.3%，水料比为0.8:1，pH 7.5~8.0。
1.2方法
1.2.1草莓根际土样中放线菌分离
稀释平板涂抹法[2,3]。称取土壤样品，溶于无菌水中，充分振荡，静置30 min后，系列稀释成不同浓度，将系列浓度的悬液接种于高氏一号平板上，涂布均匀，置于28℃恒温培养箱内培养5～7 d，用记号笔对平板上不同的放线菌进行标记，编号并进行纯化。
1.2.2草莓内生放线菌的分离
用自来水洗掉草莓根际泥沙等杂质。然后用流水冲洗30min，将新鲜样品的根和茎分别剪成0.5cm左右的小段，无菌水冲洗3次，之后转入无菌操作材料的表面消毒：用75%乙醇浸泡2min，无菌水冲洗一次，放入次氯酸钠(有效CI一10%)浸泡3min，再用无菌水冲洗4次材料表面消毒的检验：最后一次冲洗液作为对照涂抹于平板上，用于检验表面消毒是否彻底，对照如有菌落生成，表明表面消毒不彻底，弃之。
分离和培养：将消毒后的材料置于盛有少量石英沙的研钵中，加10mL无菌水研碎成汁液，静置15min后，以每皿100风涂于高氏1号培养基上，28℃倒置培养，每个处理设3次重复，挑出放线菌菌落，编号并进行纯化。
1.2.3抗菌活性测定
采用平板对峙法[5]测定放线菌对植物病原真菌的抑菌效果：将培养好的植物病原真菌用打孔器打取直径为5 mm的菌块，然后将其正放在PDA平板中央，距中央25 mm处放同样大小的供试放线菌菌块，试验重复2次。28 ℃培养至对照平板上病原真菌长满平皿，测量拮抗圈大小[4]。
1.2.4放线菌W14孢子丝形态观察
用插片法观察放线菌形态[6]。用高氏1号琼脂培养基倒平板，平板宜厚些利于插盖玻片。用无菌镊子取无菌盖玻片，在平板培养基的另一侧先插上无菌盖玻片，然后再交界线上接种（接种线长约为盖玻片的一半，即在盖玻片两端留有空白，因为放线菌的菌丝会向两边蔓延生长），将插片平板倒置于28℃温箱中培养3～7天。
目录
摘要1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言2
1 材料与方法2
1.1 材料2
1.1.1 草莓植株和草莓根际土壤样品 2
1.1.2 草莓根腐病病原菌 2
1.1.3 培养基 2
1.2 方法2
1.2.1 草莓根际土样中放线菌分离 2
1.2.2 草莓内生放线菌的分离 3
1.2.3 抗菌活性测定 3
1.2.4 放线菌W14孢子丝形态观察3
1.2.5 放线菌W14理化特征测定 3
1.2.6 菌株W14种子摇瓶培养 4
1.2.7 菌株W14的半固体发酵 4
1.2.8 菌株W14半固体发酵制剂抑制单细胞真菌活性测定 4
1.2.9 W14半固体发酵制剂中菌体数量测定4
2 结果与分析 4
2.1 放线菌的分离和培养4
2.2 放线菌菌株抑菌活性测定5
2.3 菌株Wl4菌落形态及孢子丝形态观察 6
2.3.1 菌株Wl4菌落形态 6
2.3.2 菌株Wl4孢子丝形态6
2.4 菌株Wl4生理生化特征7
2.5 菌株Wl4摇瓶种子培养及半固体发酵实验 7
2.6 菌株W14半固体发酵制剂抑制酵母菌活性测定 8
2.7 W14半固体发酵制剂数量测定9
3 讨论 10 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
致谢 11
参考文献 12
拮抗放线菌筛选、半固体发酵及其抗菌活性研究
引言
引言
草莓连作障碍在草莓种植区普遍存在，对草莓种植业危害很大，是限制草莓产业发展的瓶颈。目前，生产上防治草莓连作障碍较多采用轮作倒茬、换土、无土栽培、选用抗病品种及溴甲烷化学消毒等方法[1]。但是，这些方法也存在各种问题，如老种植区长期倒茬，现已无地可以轮作；换土工作量大，且生土肥力较低；无土栽培成本高；抗病品种选育的进展不大；溴甲烷等化学产品效果较好，但其毒性大，且会抑制土壤中的其他微生物生长。
生物防治是一种有应用前景的抗植物病害方法，而生物防治对环境中的有益微生物无影响、无残留、无污染、不杀伤天敌、不会(或较少) 产生抗药性等优点，有利于人畜安全及环境保护，其成本低、兼防兼治、增产增收，是一种无公害植保新技术。利用病原菌的拮抗菌进行生物防治，进而控制植物病害的危害是值得深入研究的一条途径。
植物病害生物防治强调的是生态系的良性循环和环境保护，由于其社会效益、生态效益、长远利益而愈来愈引起人们的重视，是符合我国农业生产持久稳定发展要求的长期策略。放线菌作为一种具有丰富资源的微生物类群，在农业植物病害生物防治中很有开发应用前景。
如果能筛选培养出对草莓病原菌有抑制作用的放线菌，就能在一定程度上解决草莓病害对草莓种植的不利影响，从而使草莓产量增长，扩大草莓产业的发展。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1草莓植株和草莓根际土壤样品
采自南京泉水镇、麒麟镇草莓种植大棚，4℃冰箱保存。
1.1.2草莓根腐病病原菌：菌株Y1、Y2、Y3、 Y5，实验室保存。
1.1.3培养基
高氏一号培养基，组分：可溶性淀粉20g、KNO3 1.0g、K2HPO4 0.5g、MgSO47H2O 0.5g、NaCl 0.5g、FeSO47H2O 0.01g、琼脂20g、H2O 1000mL、pH7.2~7.4。
PDA（马铃薯蔗糖琼脂）培养基，组分：马铃薯200g、蔗糖（或葡萄糖）20g、琼脂20g、H2O 1000mL、pH自然。
种子摇瓶培养基，组分：葡萄糖 4.5g，黄豆粉3.0g，酵母粉0.5g，碳酸钙0.5g，pH7.5，水100ml。
半固体发酵培养基，组分：麦麸80 %，玉米粉8 %，小米粉10 %，蛋白胨2 %，CaCO30.3%，水料比为0.8:1，pH 7.5~8.0。
1.2方法
1.2.1草莓根际土样中放线菌分离
稀释平板涂抹法[2,3]。称取土壤样品，溶于无菌水中，充分振荡，静置30 min后，系列稀释成不同浓度，将系列浓度的悬液接种于高氏一号平板上，涂布均匀，置于28℃恒温培养箱内培养5～7 d，用记号笔对平板上不同的放线菌进行标记，编号并进行纯化。
1.2.2草莓内生放线菌的分离
用自来水洗掉草莓根际泥沙等杂质。然后用流水冲洗30min，将新鲜样品的根和茎分别剪成0.5cm左右的小段，无菌水冲洗3次，之后转入无菌操作材料的表面消毒：用75%乙醇浸泡2min，无菌水冲洗一次，放入次氯酸钠(有效CI一10%)浸泡3min，再用无菌水冲洗4次材料表面消毒的检验：最后一次冲洗液作为对照涂抹于平板上，用于检验表面消毒是否彻底，对照如有菌落生成，表明表面消毒不彻底，弃之。
分离和培养：将消毒后的材料置于盛有少量石英沙的研钵中，加10mL无菌水研碎成汁液，静置15min后，以每皿100风涂于高氏1号培养基上，28℃倒置培养，每个处理设3次重复，挑出放线菌菌落，编号并进行纯化。
1.2.3抗菌活性测定
采用平板对峙法[5]测定放线菌对植物病原真菌的抑菌效果：将培养好的植物病原真菌用打孔器打取直径为5 mm的菌块，然后将其正放在PDA平板中央，距中央25 mm处放同样大小的供试放线菌菌块，试验重复2次。28 ℃培养至对照平板上病原真菌长满平皿，测量拮抗圈大小[4]。
1.2.4放线菌W14孢子丝形态观察
用插片法观察放线菌形态[6]。用高氏1号琼脂培养基倒平板，平板宜厚些利于插盖玻片。用无菌镊子取无菌盖玻片，在平板培养基的另一侧先插上无菌盖玻片，然后再交界线上接种（接种线长约为盖玻片的一半，即在盖玻片两端留有空白，因为放线菌的菌丝会向两边蔓延生长），将插片平板倒置于28℃温箱中培养3～7天。
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