重金属zn2+对桑园土壤磺胺类抗生素抗性菌影响及抗性菌特性研究
摘 要摘 要以镇江市蚕业研究所桑园土壤为研究对象，开展重金属锌离子对土壤中抗生素抗性菌生长数量影响的研究，这对土壤环境质量的评价和提高以及保障农产品安全等方面有着重大的现实意义。由于自然条件下土壤中微生物的生长量受多方面因素的影响，因此本文采用恒温室内培养的土壤进行研究。本研究取得了如下的成果：在恒温培养的条件下，土壤中抗生素抗性菌的生长数量以及生长状态与锌离子的浓度有着密切的关系，即土壤中细菌数量与锌离子浓度成正比。对于STZ磺胺类抗性菌，总体趋势是菌落数量随着时间的发展而增加，锌离子表现的作用为抑制前期生长活力，但不改变细菌最高数量。另外试验中所筛选出的STZ抗性菌不仅对磺胺噻唑有抗性作用，还对其他抗生素同样存在抗性作用。Zn2+和抗生素的关系有两种：拮抗关系和协同关系，协同关系中，锌离子浓度越高协同作用越小。最后经同源性分析，再结合菌株的生理生化特性可初步鉴定菌株属于Castellaniella属。关键词: 重金属锌离子；抗生素；抗性菌目 录
第一章 绪 论 1
1.1 引言 1
1.2 重金属对土壤及土壤微生物的污染 1
1.3 土壤中重金属和抗生素污染的现状 3
1.4 本研究的目的及意义 5
第二章 重金属Zn2+及抗生素对土壤中菌落生长的影响 6
2.1 引言 6
2.2 材料与方法 7
2.2.1 材料 7
2.2.2 方法 8
2.3 结果与分析 9
2.4 本章小结 10
第三章 抗性菌的特性研究 11
3.1 引言 11
3.2 材料与方法 12
3.2.1 抗性菌生长曲线测定 12
3.2.2 抗性菌生理生化鉴定 12
3.2.3 抗性菌交叉试验鉴定 16
3.2.4 抗性菌PCR鉴定 17
3.3 结果与分析 18
3.3.1 生长曲线 18
3.3.2 生理生化鉴定 19
3.3.3 交叉试验鉴定 20
3.3.4 PCR鉴定 21
3.4 本章小结 21
结 论 22
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
12
3.2.3 抗性菌交叉试验鉴定 16
3.2.4 抗性菌PCR鉴定 17
3.3 结果与分析 18
3.3.1 生长曲线 18
3.3.2 生理生化鉴定 19
3.3.3 交叉试验鉴定 20
3.3.4 PCR鉴定 21
3.4 本章小结 21
结 论 22
致 谢 23
参 考 文 献 24
第一章 绪 论
1.1 引言
作为人类生活的物质基础，土壤同时也是食物链和生态系统中的重要组成部分。由于污染物的数量不断增加，土壤的环境容量被降低，其环境容量被减小，其中尤为突出的就是重金属污染。农药化肥的不合理使用、矿山开采的不合理性以及加工过程对环境的不重视性，还有生活垃圾的随意堆放和不合理的处置都会导致重金属的污染。
由于重金属污染与人体健康的爆发有着密切的联系，在日本的“水俣病”事件发生后，土壤重金属污染已成为国内外学者研究的重点内容。土壤中重金属的降解浓度很大，还有巨大的毒性，同时还有可逆转性，隐蔽性以及滞后性，同时还有积累的效应，所以专家及学者开始将钻研重心转向重金属污染下的土壤微生物活动，如重金属对土壤微生物和土壤酶活性的影响。以往重金属对土壤的污染和修复一直通过采用化学和物理的技术来评判，比如将重金属拮抗剂添加在土壤中、土壤淋洗、电热修复，以及电动修复等技术。这些方法虽然有一定的效果，但是投资巨大，并且适用的范围不广。当今微生物学对重金属污染的目标评估愈来愈受到人们的关心。近来,国内还有国外的研究者针对重金属对土壤生物和生态效应的污染等多方面，进行了大量的工作，而且在重金属污染泥土的微生物学评估方面得到一些研究成果。对于重金属污染对农业，林业等相关产业以及人体健康的影响已经成为急需解决的问题[1,2]。
1.2 重金属对土壤及土壤微生物的污染
当今我国遭遇不同程度污染的耕地土地面积已达到200万hm2,大概占总耕地面积的1/5。根据研究调查, 我国二十多个省市城郊、污水灌溉区、工矿等经济发展领先地区的三百多个的重要污染区域中，大田作物的种植面积超过了标准600000 hm2，和监测总面积的五分之一，其污染物超过农产品总量的80%，重金属含量的总面积超过了农产品的标准，特别是产量和面积，最突出的是铅，镉，汞，铜的复合污染[3]。在我国，每年作为饲料添加剂的抗生素使用量超过了8000吨。在养殖业通常喜欢在饲料中添加抗生素来减少养殖物的患病病率和增大饲料的使用效率，结果就会导致动物不能够消化大多数抗生素，最后形成随着粪便和尿液排泄出体外的母体药物[4]。滥用抗生素，甚至人药兽用，增加了抗生素的环境危害和生态风险。同时重金属的污染来源广泛，且具有生物堆积性、长久性和不能逆转性，一直备受关心。重金属和抗生素是相当受人们关注的污染物，其二者的复合污染现象也愈来愈普遍，例如畜禽养殖的固废和废水、施用粪肥的土壤环境等[5]。
当今社会中重金属的价格在一些含金属矿产丰富的地区,为了盲目追求经济利益上升趋势的增加，大力投资使其粗放式发展，导致为数众多、规模不等的小采矿厂和小冶炼厂如雨后春笋般出现。因为目前的一些企业技术相对的落后。设备能力也较低，在矿石开采、冶炼、加工的过程中，会产生大量的粉尘和废气等污染物。尤其国内的一些生产企业，污水处理企业的重金属修复性不强，大多含有重金属的废水、废渣、废气、俗称“三废”排放到自然环境中，以及重金属矿产的开发和利用的全部过程给周边环境形成了巨大的环境污染。同时工业布局的不合理，污染物排放的比较集中，也致使部分地区的污染形成叠加的影响，局部环境质量的恶化，导致一些地域的怪病一再涌现。矿物加工和冶炼、电镀、塑料、电池、化工等以三废方式排放的污染物使工厂的周围的土壤和水源中重金属含量严重超标[6]。
土壤中微生物是泥土壤中的首要的组成部分，它和其余的要素同时制约着土壤的本质属性。而且对土壤肥力和土壤养分变化的，引起对分化和自我净化和输入到土壤中的农药等有机污染物都起着重要的作用,另外对变化环境中的有毒金属及其化合物也很重要。所以，在研究重金属因素对土壤的影响时，研究土壤中微生物系统的变化肯定是及其重要的。近年来，一些国家在对污染物的控制与治理中，提出了“环境负荷”的概念，并从总量的角度对污染物加以控制。因此，对土壤污染的研究，仅着眼于土壤的生产机能是不够的，还要研究污染物对整个土壤生态系统的环境保护机能的影响。其中土壤微生物系统的变化可直接影响到土壤生态系统的质量，成为土壤质量优劣的重要标志之一[7]。
重金属对土壤的污染向来是环境科学研究中的一个重点。重金属污染会破坏土壤环境质量，严重干扰植物的生长和威胁人畜的健康。由于土壤中重金属的生物有效性很难根据总量目标测出，同时测定方法等其他因素又影响着有效量指标，所以可比较性较低[8]。近来有学者研究得出土壤抗生素的抗性由于重金属所以存在明显的浓度效应[9]。费尔南德斯卡尔维诺等[30]研究显示当土壤中Cu污染达到8 mmol/kg以上时，将会诱发四环素产生了抗性，而达到16 mmol/kg以上时，诱导土壤细菌产生泰乐菌素和万古菌素的抗性。
反映土壤中生态系统稳定性和群落结构的首要的参数就是微生物种群构造。近年来，国内外学者选用先进的碳，脂肪酸甲酯（PLFA）来分析土壤微生物的结构和作用，研究和检测核酸，以及构造的多样性。Knight等研究了镉，铜，锌对土壤微生物的功能多样性的污染，所采用的是生物微平板反应体系。Kell等探讨了土壤微生物群落在锌污染后的状态，也利用与Knight同样的方法，研究得出锌污染的确可以改变土壤中微生物群落的
第一章 绪 论 1
1.1 引言 1
1.2 重金属对土壤及土壤微生物的污染 1
1.3 土壤中重金属和抗生素污染的现状 3
1.4 本研究的目的及意义 5
第二章 重金属Zn2+及抗生素对土壤中菌落生长的影响 6
2.1 引言 6
2.2 材料与方法 7
2.2.1 材料 7
2.2.2 方法 8
2.3 结果与分析 9
2.4 本章小结 10
第三章 抗性菌的特性研究 11
3.1 引言 11
3.2 材料与方法 12
3.2.1 抗性菌生长曲线测定 12
3.2.2 抗性菌生理生化鉴定 12
3.2.3 抗性菌交叉试验鉴定 16
3.2.4 抗性菌PCR鉴定 17
3.3 结果与分析 18
3.3.1 生长曲线 18
3.3.2 生理生化鉴定 19
3.3.3 交叉试验鉴定 20
3.3.4 PCR鉴定 21
3.4 本章小结 21
结 论 22
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
12
3.2.3 抗性菌交叉试验鉴定 16
3.2.4 抗性菌PCR鉴定 17
3.3 结果与分析 18
3.3.1 生长曲线 18
3.3.2 生理生化鉴定 19
3.3.3 交叉试验鉴定 20
3.3.4 PCR鉴定 21
3.4 本章小结 21
结 论 22
致 谢 23
参 考 文 献 24
第一章 绪 论
1.1 引言
作为人类生活的物质基础，土壤同时也是食物链和生态系统中的重要组成部分。由于污染物的数量不断增加，土壤的环境容量被降低，其环境容量被减小，其中尤为突出的就是重金属污染。农药化肥的不合理使用、矿山开采的不合理性以及加工过程对环境的不重视性，还有生活垃圾的随意堆放和不合理的处置都会导致重金属的污染。
由于重金属污染与人体健康的爆发有着密切的联系，在日本的“水俣病”事件发生后，土壤重金属污染已成为国内外学者研究的重点内容。土壤中重金属的降解浓度很大，还有巨大的毒性，同时还有可逆转性，隐蔽性以及滞后性，同时还有积累的效应，所以专家及学者开始将钻研重心转向重金属污染下的土壤微生物活动，如重金属对土壤微生物和土壤酶活性的影响。以往重金属对土壤的污染和修复一直通过采用化学和物理的技术来评判，比如将重金属拮抗剂添加在土壤中、土壤淋洗、电热修复，以及电动修复等技术。这些方法虽然有一定的效果，但是投资巨大，并且适用的范围不广。当今微生物学对重金属污染的目标评估愈来愈受到人们的关心。近来,国内还有国外的研究者针对重金属对土壤生物和生态效应的污染等多方面，进行了大量的工作，而且在重金属污染泥土的微生物学评估方面得到一些研究成果。对于重金属污染对农业，林业等相关产业以及人体健康的影响已经成为急需解决的问题[1,2]。
1.2 重金属对土壤及土壤微生物的污染
当今我国遭遇不同程度污染的耕地土地面积已达到200万hm2,大概占总耕地面积的1/5。根据研究调查, 我国二十多个省市城郊、污水灌溉区、工矿等经济发展领先地区的三百多个的重要污染区域中，大田作物的种植面积超过了标准600000 hm2，和监测总面积的五分之一，其污染物超过农产品总量的80%，重金属含量的总面积超过了农产品的标准，特别是产量和面积，最突出的是铅，镉，汞，铜的复合污染[3]。在我国，每年作为饲料添加剂的抗生素使用量超过了8000吨。在养殖业通常喜欢在饲料中添加抗生素来减少养殖物的患病病率和增大饲料的使用效率，结果就会导致动物不能够消化大多数抗生素，最后形成随着粪便和尿液排泄出体外的母体药物[4]。滥用抗生素，甚至人药兽用，增加了抗生素的环境危害和生态风险。同时重金属的污染来源广泛，且具有生物堆积性、长久性和不能逆转性，一直备受关心。重金属和抗生素是相当受人们关注的污染物，其二者的复合污染现象也愈来愈普遍，例如畜禽养殖的固废和废水、施用粪肥的土壤环境等[5]。
当今社会中重金属的价格在一些含金属矿产丰富的地区,为了盲目追求经济利益上升趋势的增加，大力投资使其粗放式发展，导致为数众多、规模不等的小采矿厂和小冶炼厂如雨后春笋般出现。因为目前的一些企业技术相对的落后。设备能力也较低，在矿石开采、冶炼、加工的过程中，会产生大量的粉尘和废气等污染物。尤其国内的一些生产企业，污水处理企业的重金属修复性不强，大多含有重金属的废水、废渣、废气、俗称“三废”排放到自然环境中，以及重金属矿产的开发和利用的全部过程给周边环境形成了巨大的环境污染。同时工业布局的不合理，污染物排放的比较集中，也致使部分地区的污染形成叠加的影响，局部环境质量的恶化，导致一些地域的怪病一再涌现。矿物加工和冶炼、电镀、塑料、电池、化工等以三废方式排放的污染物使工厂的周围的土壤和水源中重金属含量严重超标[6]。
土壤中微生物是泥土壤中的首要的组成部分，它和其余的要素同时制约着土壤的本质属性。而且对土壤肥力和土壤养分变化的，引起对分化和自我净化和输入到土壤中的农药等有机污染物都起着重要的作用,另外对变化环境中的有毒金属及其化合物也很重要。所以，在研究重金属因素对土壤的影响时，研究土壤中微生物系统的变化肯定是及其重要的。近年来，一些国家在对污染物的控制与治理中，提出了“环境负荷”的概念，并从总量的角度对污染物加以控制。因此，对土壤污染的研究，仅着眼于土壤的生产机能是不够的，还要研究污染物对整个土壤生态系统的环境保护机能的影响。其中土壤微生物系统的变化可直接影响到土壤生态系统的质量，成为土壤质量优劣的重要标志之一[7]。
重金属对土壤的污染向来是环境科学研究中的一个重点。重金属污染会破坏土壤环境质量，严重干扰植物的生长和威胁人畜的健康。由于土壤中重金属的生物有效性很难根据总量目标测出，同时测定方法等其他因素又影响着有效量指标，所以可比较性较低[8]。近来有学者研究得出土壤抗生素的抗性由于重金属所以存在明显的浓度效应[9]。费尔南德斯卡尔维诺等[30]研究显示当土壤中Cu污染达到8 mmol/kg以上时，将会诱发四环素产生了抗性，而达到16 mmol/kg以上时，诱导土壤细菌产生泰乐菌素和万古菌素的抗性。
反映土壤中生态系统稳定性和群落结构的首要的参数就是微生物种群构造。近年来，国内外学者选用先进的碳，脂肪酸甲酯（PLFA）来分析土壤微生物的结构和作用，研究和检测核酸，以及构造的多样性。Knight等研究了镉，铜，锌对土壤微生物的功能多样性的污染，所采用的是生物微平板反应体系。Kell等探讨了土壤微生物群落在锌污染后的状态，也利用与Knight同样的方法，研究得出锌污染的确可以改变土壤中微生物群落的
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