利用化学诱变提高沙漠微藻的生物量及油脂产量
从微藻中提取生物柴油是现代获得可再生清洁能源的途径之一，其中藻类的生物量和脂生产量是影响生物柴油的两大因素。我们可以通过各种物理、化学和生物方法诱变微藻细胞，培育后使其产生较高的脂含量。在这项研究中，我们加入甲烷磺酸乙酯(EMS)诱变剂来诱导两种链带藻变异，并提高它们的油脂含量，这两个藻株分别命名为XJ-S81和XJ-G41。在藻细胞液中加入不同浓度的诱变剂，培育不等时间（分别培育30min和60min）后，通过尼罗红荧光剂在所有的突变株里筛选出荧光度最强的5个，其中S81的突变体里选出2个样藻，G41的选出3个。通过比较它们的生长速率、叶绿素含量、生物产量和生产力，分析脂质含量、油脂生产率以及单细胞油脂含量，最有产油潜力的两个突变藻S5和G3脱颖而出。与野生型原株相比，S5和G3的生物量，油脂含量和脂生产力均大大增加。这些结果表明,这种突变是提高微藻的生物量和脂含量，可生产生物燃料的有效途径。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1.材料与方法2
1.1 微藻藻株和培养条件2
1.2突变过程2
1.3通过尼罗红荧光法筛选富油藻株3
1.4生长状况和叶绿素含量的测定3
1.5总脂质的提取和分析3
1.6统计分析3
2.结果与分析3
2.1诱变细胞的存活率(%)3
2.2根据相对中性脂含量，用尼罗红染色筛选突变体 4
2.3细胞生长和叶绿素含量5
2.4生物量产量和比生长速率6
2.5脂质分析7
2.5.1总脂含量，油脂生产力和单细胞脂含量7
2.6生物量和脂质特性的稳定性8
3.讨论8
致谢8
参考文献9
利用化学诱变提高沙漠微藻的生物量及油脂产量
引言
能源危机和环境问题是人类目前面临的两大严重问题。随着世界经济持续快速的发展，各国对能源的需求与日俱增，化石储量急剧减少，而其他不可再生资源更是少之又少。有报道所称，现有的化石燃料在未来半个世纪后可能要遭 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
遇枯竭[1]。加之燃烧化石燃料会排放大量的二氧化碳、一氧化碳、甲烷等温室气体或有害气体，不但严重影响自然环境质量，而且导致环境最关注的重要问题，即全球变暖。因此，发展新的可再生清洁能源势在必行。利用可再生生物燃料来替代传统燃料，是近年来全球科学家研究的观点之一。目前，最有发展潜力的替代燃料之一是微藻生物柴油。据了解，微藻能很好的适应周围的环境并迅速生长，单位面积的油脂产量也比其他陆地植物高。更重要的是，由于人类的生存发展，农用可用土地在不断减少，已经造成生物能源作物与食物饲料生产之间的竞争，这就要求可再生的生物燃料不能消耗有限的人力资源。而微藻可以在含盐的或非肥沃的土壤环境中生存，意味着它的生长模式不与耕地作物相冲突[2]，不占用耕地面积，这也是选择微藻作为获取生物燃料的最佳对象的理由。尽管如此，由于利用微藻提取和转化生物柴油的过程成本较高，生产力略低，加上遇到的技术瓶颈尚未解决，这一生产过程并未被广泛的商业化。因此，如何筛选出高产油脂的植株，是生物柴油有效商业化的基础和研究者们首要考虑的问题[3]。
除了从野外生长地择选优良的富油藻株，物理和化学诱变以及基因操作也是提高微藻脂质含量，获取富油藻的重要方法。物理诱变包括激光、超声波、粒子束及各方式之间的复合反应，目前最常见的突变方法是紫外线诱变[47]。然而,一些研究人员已经表明,长期暴露在紫外线下会抑制微藻的生长，而且还会影响部分藻类酶的活性以及脂肪酸的合成[810]。使用基因沉默与基因敲除等技术，在微藻中的应用里已经日趋成熟，使得基因工程在微藻中的应用更加方便。为了获得新的高效基因型微藻，转基因微藻研究开始备受瞩目。但为了生产生物柴油而培育新的微藻株系，目前最主要的障碍是缺乏有效转化方法[11]。化学诱变的优势在于染色体畸变少,突变率高。近年来,甲磺酸乙酯(EMS)和亚硝基甲基胍(NTG)得到了广泛的应用，其中甲烷磺酸乙酯(EMS)在多方面培育育种里都有所涉及[1214]，但是很少有研究报告提及将EMS突变应用在微藻上来提高育种。并且，除了化学诱变共有的优点以外，EMS诱变的突变体还有显性优势，对于筛选特定突变体非常有效。综上考虑，在这项工作中我们用EMS作为化学诱变剂。
链带藻属于栅列藻的一种，通常用于去除废水里的养分物质以及生产生物柴油。曾有研究表明[15]，将链带藻在混合废水（猪场废水和经过二次处理的城市废水混合比为1：3）中培养，在生长后期所得到的最大生物产量和脂含量分别为840mg/L和20.37%，说明在厌氧的污水环境中链带藻的生物产量有所增加。将链带藻从污水中分离出来培养，其表现出迅速生长的特性，同时检测到培养基内的油脂含量所占比重高达干重的55%[16]。一切结果都表明链带藻很适合于生物柴油的生产。
本次实验的主要内容包括在藻细胞中加入不同剂量的诱变剂，基于相对中性脂含量，用尼罗红筛选出具有产油潜力的突变藻株，检测它们的生长情况、生物量并进一步分析它们的脂质特性。
材料与方法
1.1微藻藻株和培养条件
将所研究的微藻从新疆沙漠生长地区采集出来，并根据其形态学特征和rDNA序列确认为链带藻。藻株暂命名为XJS81和XJG41，分别培养在两个含有200ml BG11的250ml容量瓶中。培养条件为：光照度80μmol m2s1, 光暗周期比14：10，温度25±1℃。培养基的ph为7.0±0.1，每天摇动容量瓶六次。
1.2突变过程
取S81和G41在对数生长期的细胞悬浊液，检测出它们的细胞密度分别为3.1×106和4.4×106细胞/ml，加入不同浓度的甲烷磺酸乙酯(EMS，0.6、0.7、0.8和0.9M，加有pH值为7.0的磷酸盐缓冲剂)，在25±1℃的黑暗环境下进行培养，并在不同时间段(30min和60min)后适当摇动。将培养的藻细胞在10000rpm的离心机下离心10min，用高压蒸汽处理过的10%(w/v)硫代硫酸钠溶液洗涤后，再用无菌BG11去除残余的EMS。将处理过的藻细胞重悬于无菌BG11培养基中，适当稀释后，把细胞液涂布在1.5%的琼脂培养皿上，在暗环境下保存12h，培养4周后根据培养皿上已长出的单藻落数确定细胞存活率，每个诱变处理条件下进行三次平行试验。
1.3通过尼罗红荧光法筛选富油藻种
将迅速生长的藻株转移到液体培养基中进一步培养。已知尼罗红染色法是根据中性脂质的相对含量进行筛选的，其强度能反映出藻细胞的不同生长情况。首先取1ml细胞悬浮液和330μl 25%(v/v)的二甲亚砜(DMSO)水溶液混合物以超声波降解处理20s，再加入15μl尼罗红，在40℃下水浴10min。着色藻细胞的荧光强度以光谱形式记录在酶标仪上，将激发光和发射光波长分别设置为475nm和570nm，做三个平行试验分析。得到结果后，从S81所有的诱变体中挑选出荧光强度最高的2个突变藻，从G41的诱变体中挑出荧光强度最高的3个突变藻，再进行下一步测定分析。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1.材料与方法2
1.1 微藻藻株和培养条件2
1.2突变过程2
1.3通过尼罗红荧光法筛选富油藻株3
1.4生长状况和叶绿素含量的测定3
1.5总脂质的提取和分析3
1.6统计分析3
2.结果与分析3
2.1诱变细胞的存活率(%)3
2.2根据相对中性脂含量，用尼罗红染色筛选突变体 4
2.3细胞生长和叶绿素含量5
2.4生物量产量和比生长速率6
2.5脂质分析7
2.5.1总脂含量，油脂生产力和单细胞脂含量7
2.6生物量和脂质特性的稳定性8
3.讨论8
致谢8
参考文献9
利用化学诱变提高沙漠微藻的生物量及油脂产量
引言
能源危机和环境问题是人类目前面临的两大严重问题。随着世界经济持续快速的发展，各国对能源的需求与日俱增，化石储量急剧减少，而其他不可再生资源更是少之又少。有报道所称，现有的化石燃料在未来半个世纪后可能要遭 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
遇枯竭[1]。加之燃烧化石燃料会排放大量的二氧化碳、一氧化碳、甲烷等温室气体或有害气体，不但严重影响自然环境质量，而且导致环境最关注的重要问题，即全球变暖。因此，发展新的可再生清洁能源势在必行。利用可再生生物燃料来替代传统燃料，是近年来全球科学家研究的观点之一。目前，最有发展潜力的替代燃料之一是微藻生物柴油。据了解，微藻能很好的适应周围的环境并迅速生长，单位面积的油脂产量也比其他陆地植物高。更重要的是，由于人类的生存发展，农用可用土地在不断减少，已经造成生物能源作物与食物饲料生产之间的竞争，这就要求可再生的生物燃料不能消耗有限的人力资源。而微藻可以在含盐的或非肥沃的土壤环境中生存，意味着它的生长模式不与耕地作物相冲突[2]，不占用耕地面积，这也是选择微藻作为获取生物燃料的最佳对象的理由。尽管如此，由于利用微藻提取和转化生物柴油的过程成本较高，生产力略低，加上遇到的技术瓶颈尚未解决，这一生产过程并未被广泛的商业化。因此，如何筛选出高产油脂的植株，是生物柴油有效商业化的基础和研究者们首要考虑的问题[3]。
除了从野外生长地择选优良的富油藻株，物理和化学诱变以及基因操作也是提高微藻脂质含量，获取富油藻的重要方法。物理诱变包括激光、超声波、粒子束及各方式之间的复合反应，目前最常见的突变方法是紫外线诱变[47]。然而,一些研究人员已经表明,长期暴露在紫外线下会抑制微藻的生长，而且还会影响部分藻类酶的活性以及脂肪酸的合成[810]。使用基因沉默与基因敲除等技术，在微藻中的应用里已经日趋成熟，使得基因工程在微藻中的应用更加方便。为了获得新的高效基因型微藻，转基因微藻研究开始备受瞩目。但为了生产生物柴油而培育新的微藻株系，目前最主要的障碍是缺乏有效转化方法[11]。化学诱变的优势在于染色体畸变少,突变率高。近年来,甲磺酸乙酯(EMS)和亚硝基甲基胍(NTG)得到了广泛的应用，其中甲烷磺酸乙酯(EMS)在多方面培育育种里都有所涉及[1214]，但是很少有研究报告提及将EMS突变应用在微藻上来提高育种。并且，除了化学诱变共有的优点以外，EMS诱变的突变体还有显性优势，对于筛选特定突变体非常有效。综上考虑，在这项工作中我们用EMS作为化学诱变剂。
链带藻属于栅列藻的一种，通常用于去除废水里的养分物质以及生产生物柴油。曾有研究表明[15]，将链带藻在混合废水（猪场废水和经过二次处理的城市废水混合比为1：3）中培养，在生长后期所得到的最大生物产量和脂含量分别为840mg/L和20.37%，说明在厌氧的污水环境中链带藻的生物产量有所增加。将链带藻从污水中分离出来培养，其表现出迅速生长的特性，同时检测到培养基内的油脂含量所占比重高达干重的55%[16]。一切结果都表明链带藻很适合于生物柴油的生产。
本次实验的主要内容包括在藻细胞中加入不同剂量的诱变剂，基于相对中性脂含量，用尼罗红筛选出具有产油潜力的突变藻株，检测它们的生长情况、生物量并进一步分析它们的脂质特性。
材料与方法
1.1微藻藻株和培养条件
将所研究的微藻从新疆沙漠生长地区采集出来，并根据其形态学特征和rDNA序列确认为链带藻。藻株暂命名为XJS81和XJG41，分别培养在两个含有200ml BG11的250ml容量瓶中。培养条件为：光照度80μmol m2s1, 光暗周期比14：10，温度25±1℃。培养基的ph为7.0±0.1，每天摇动容量瓶六次。
1.2突变过程
取S81和G41在对数生长期的细胞悬浊液，检测出它们的细胞密度分别为3.1×106和4.4×106细胞/ml，加入不同浓度的甲烷磺酸乙酯(EMS，0.6、0.7、0.8和0.9M，加有pH值为7.0的磷酸盐缓冲剂)，在25±1℃的黑暗环境下进行培养，并在不同时间段(30min和60min)后适当摇动。将培养的藻细胞在10000rpm的离心机下离心10min，用高压蒸汽处理过的10%(w/v)硫代硫酸钠溶液洗涤后，再用无菌BG11去除残余的EMS。将处理过的藻细胞重悬于无菌BG11培养基中，适当稀释后，把细胞液涂布在1.5%的琼脂培养皿上，在暗环境下保存12h，培养4周后根据培养皿上已长出的单藻落数确定细胞存活率，每个诱变处理条件下进行三次平行试验。
1.3通过尼罗红荧光法筛选富油藻种
将迅速生长的藻株转移到液体培养基中进一步培养。已知尼罗红染色法是根据中性脂质的相对含量进行筛选的，其强度能反映出藻细胞的不同生长情况。首先取1ml细胞悬浮液和330μl 25%(v/v)的二甲亚砜(DMSO)水溶液混合物以超声波降解处理20s，再加入15μl尼罗红，在40℃下水浴10min。着色藻细胞的荧光强度以光谱形式记录在酶标仪上，将激发光和发射光波长分别设置为475nm和570nm，做三个平行试验分析。得到结果后，从S81所有的诱变体中挑选出荧光强度最高的2个突变藻，从G41的诱变体中挑出荧光强度最高的3个突变藻，再进行下一步测定分析。
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