拟南芥五价砷敏感突变体ayl1生理表型分析
摘要：砷污染在全世界尤其是东南亚已经变成一个日益严重的环境问题。砷不仅毒害植物，还会通过食物链进入人体和动物体，严重威胁到人类的健康。而拟南芥作为研究植物代谢机制方面重要的模式植物，在砷的吸收、转运和贮存等机制的研究中起着重要作用。在之前的实验中，我们在PCS基因突变基础上筛选到了一株对五价砷更敏感的突变体ayl-1（Sensitive to Arsenate with Yellow Leaf），本实验我们对突变体的生理表型做初步分析，结果发现，五价砷浓度大于4 μM 时，ayl-1的地上部生长开始受到抑制，主要表现为叶片失绿黄化，叶绿素含量下降。
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 2
Key Words 2
引言 2
1 材料与方法 3
1.1 材料 4
1.2 实验方法 4
1.2.1 地上部和根部的表型分析实验 4
1.2.2 叶绿素含量测定实验 4
1.2.3 营养生长期水培As（V）浓度梯度实验 4
1.2.4 透射电镜叶片叶绿体形态分析实验 4
1.2.5 克隆与确认基因 4
1.3 数据处理 4
2 结果与分析 4
2.1地上部和根部的表型分析实验 4
2.1.1 根部表型分析实验 4
2.1.2地上部表型分析实验 5
2.2 叶绿素含量测定 6
2.3营养生长期水培As（V）浓度梯度实验 8
2.4透射电镜叶片叶绿体形态分析 9
2.5基因的克隆与确认 10
3 讨论 11
3.1 突变体ayl1在地上部对五价砷胁迫更敏感 11
3.2 突变体ayl1受五价砷胁迫后叶绿素含量相对野生型显著降低 11
3.3 突变体ayl1在水培条件下也表现出对五价砷的敏感性 11
3.4 低浓度五价砷下突变体ayl1叶绿体形态和野生型没有显著不同 11
3.5 At3g17830基因突变可能是造成突变体ayl1表型的原因 12
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
致谢 12
参考文献 12
拟南芥五价砷敏感突变体ayl1生理表型分析
引言
砷是广泛存在于自然界且毒性很强的重金属，是公认的致癌物质。无机砷可以通过食物和饮用水进入人体和动物体[1]。近年来，世界上许多国家尤其是东南亚国家，发生多起砷中毒事件[2]，引起了极大的社会关注，促使科学家们致力于对砷从环境进入植物体，及在植物体内转化、运输和贮存等过程和机制的深入研究。拟南芥作为植物分子研究重要的模式植物，以拟南芥作为实验材料进行研究，对之后研究水稻对砷的代谢有重大的借鉴意义。
在自然环境中，砷的形态主要分为无机态和有机态，无机态包括三价砷和五价砷，有机态主要主要以单甲基砷和二甲基砷为主，砷的毒性与其存在形态密切相关，通常可溶性无机砷的毒性远大于有机砷，其中三价砷的毒性大于五价砷。在土壤中砷主要以三价砷和五价砷的形态存在，二者会随着土壤pH和Eh的变化而转化[3]：在淹水土壤中，主要存在形式是三价砷；在旱地土壤中，主要以五价砷存在。同时无机砷能在土壤微生物的参与下转化成形态不同的有机砷，不同形态的砷通过不同的机制被植物吸收[4]。
砷和磷是同族元素，五价砷酸盐和磷酸盐具有相似的化学性质。研究表明，在高等植物中，砷酸根和磷酸根共用相同的吸收转运蛋白[5]，因此，环境中磷酸盐的含量会影响植物对砷酸盐的吸收[6]。五价砷通过磷吸收转运蛋白进入植物体后，在砷酸还原酶的作用下，被很快还原为三价砷[7]。三价砷与特异的膜蛋白结合泵出细胞，或者与谷胱甘肽（GSH）或植物螯合肽（PCs）结合后转运到液泡中，从而达到对五价砷的解毒[8]。研究已经发现拟南芥位于液泡膜上负责转运含砷络合物的转运体[9]，但是目前为止，还未找到位于细胞膜上专门负责三价砷泵出细胞的膜蛋白[10]。
图1 五价砷细胞代谢模式图[11]
三价砷的毒性远大于五价砷，因为三价砷对多肽上的巯基（SH）具有较高的亲和力，其毒性表现在与蛋白质上的巯基结合，从而影响其结构和功能[8]。植物解除三价砷毒性的途径是合成富含巯基的多肽，如谷胱甘肽和植物络合素与三价砷结合，络合物通过液泡膜上的蛋白进入液泡而被区室化，使三价砷不能与具有一定功能的蛋白质结合而失去毒性。
因此，在五价砷植物体内代谢的过程中，谷胱甘肽和植物络合素具有重要作用，而它们在植物体内合成涉及到两个重要的基因：GSH1和PCS1。GSH1是负责γ谷氨酰半胱氨酸合成酶催化谷胱甘肽合成的重要基因，该基因突变会导致谷胱甘肽合成量下降，突变体对重金属镉和砷的耐性降低[12]；PCS1是负责植物螯合肽合酶催化植物螯合肽合成的重要基因[13]。cad13是PCS1基因在CAD13位点突变的突变体，cad13突变体内的植物螯合肽含量降低，并且也会对重金属镉、砷的耐性降低。为了了解更多关于植物体内砷的解毒过程，我们对cad13突变体进行诱变，建立突变体库，筛选对五价砷敏感的突变体。在之前的筛选过程中，我们筛选到了1株在cad13突变基础上对五价砷更敏感的突变体ayl1（Sensitive to Arsenate with Yellow Leaf），为了更好地了解该突变基因在五价砷解毒过程中的作用，我们设计了竖板培养、水培毒害、叶绿素含量测定等实验，对突变体的生理表型进行初步分析。
1 材料与方法
1.1 材料
植物材料：拟南芥敏感突变体Col0（野生型）,cad13，ayl1
1.2 实验方法
1.2.1 地上部和根部的表型分析实验 1/2MS培养基的配置：1升1/2MS培养基加入MS培养基粉末 2.37g，蔗糖20g，加入琼脂后，pH至5.5，竖板培养基琼脂浓度为1%，平板琼脂浓度为0.8%，用高压蒸汽灭菌法，121℃灭菌20min。拟南芥种子4℃春化3d后，用8%的次氯酸钠灭菌后，播到五价砷浓度为0、1、2、4、6、8μM 的培养基上。在22℃／14h光照和22℃／8h黑暗培养条件下培养10d。
1.2.2 叶绿素含量测定实验 将在竖板上培养10天的Col0、cad13、ayl1苗拍照，并使用Image J软件对根长进行测定。将地上部剪下来，每取50棵拟南芥的地上部为一个重复，共3个重复，称量鲜重。将称重后的样品在液氮中冷冻研磨打碎，加入400μL 80%丙酮提取液，震荡涡旋后在4℃ 15000rpm转速离心10min。提取上清液至新的离心管，重复上述步骤，其中加入的80%丙酮分步为400μL，1000μL，200μL。最后获得2ml上清液。取100μL加入900μL 80%丙酮至新的离心管稀释10倍之后，使用紫外/可见分光光度计，分别测定样品在470、646.6、663.6nm的吸收值，按照公式计算叶绿素a和叶绿素b的含量：
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摘要 2
关键词 2
Abstract 2
Key Words 2
引言 2
1 材料与方法 3
1.1 材料 4
1.2 实验方法 4
1.2.1 地上部和根部的表型分析实验 4
1.2.2 叶绿素含量测定实验 4
1.2.3 营养生长期水培As（V）浓度梯度实验 4
1.2.4 透射电镜叶片叶绿体形态分析实验 4
1.2.5 克隆与确认基因 4
1.3 数据处理 4
2 结果与分析 4
2.1地上部和根部的表型分析实验 4
2.1.1 根部表型分析实验 4
2.1.2地上部表型分析实验 5
2.2 叶绿素含量测定 6
2.3营养生长期水培As（V）浓度梯度实验 8
2.4透射电镜叶片叶绿体形态分析 9
2.5基因的克隆与确认 10
3 讨论 11
3.1 突变体ayl1在地上部对五价砷胁迫更敏感 11
3.2 突变体ayl1受五价砷胁迫后叶绿素含量相对野生型显著降低 11
3.3 突变体ayl1在水培条件下也表现出对五价砷的敏感性 11
3.4 低浓度五价砷下突变体ayl1叶绿体形态和野生型没有显著不同 11
3.5 At3g17830基因突变可能是造成突变体ayl1表型的原因 12
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
致谢 12
参考文献 12
拟南芥五价砷敏感突变体ayl1生理表型分析
引言
砷是广泛存在于自然界且毒性很强的重金属，是公认的致癌物质。无机砷可以通过食物和饮用水进入人体和动物体[1]。近年来，世界上许多国家尤其是东南亚国家，发生多起砷中毒事件[2]，引起了极大的社会关注，促使科学家们致力于对砷从环境进入植物体，及在植物体内转化、运输和贮存等过程和机制的深入研究。拟南芥作为植物分子研究重要的模式植物，以拟南芥作为实验材料进行研究，对之后研究水稻对砷的代谢有重大的借鉴意义。
在自然环境中，砷的形态主要分为无机态和有机态，无机态包括三价砷和五价砷，有机态主要主要以单甲基砷和二甲基砷为主，砷的毒性与其存在形态密切相关，通常可溶性无机砷的毒性远大于有机砷，其中三价砷的毒性大于五价砷。在土壤中砷主要以三价砷和五价砷的形态存在，二者会随着土壤pH和Eh的变化而转化[3]：在淹水土壤中，主要存在形式是三价砷；在旱地土壤中，主要以五价砷存在。同时无机砷能在土壤微生物的参与下转化成形态不同的有机砷，不同形态的砷通过不同的机制被植物吸收[4]。
砷和磷是同族元素，五价砷酸盐和磷酸盐具有相似的化学性质。研究表明，在高等植物中，砷酸根和磷酸根共用相同的吸收转运蛋白[5]，因此，环境中磷酸盐的含量会影响植物对砷酸盐的吸收[6]。五价砷通过磷吸收转运蛋白进入植物体后，在砷酸还原酶的作用下，被很快还原为三价砷[7]。三价砷与特异的膜蛋白结合泵出细胞，或者与谷胱甘肽（GSH）或植物螯合肽（PCs）结合后转运到液泡中，从而达到对五价砷的解毒[8]。研究已经发现拟南芥位于液泡膜上负责转运含砷络合物的转运体[9]，但是目前为止，还未找到位于细胞膜上专门负责三价砷泵出细胞的膜蛋白[10]。
图1 五价砷细胞代谢模式图[11]
三价砷的毒性远大于五价砷，因为三价砷对多肽上的巯基（SH）具有较高的亲和力，其毒性表现在与蛋白质上的巯基结合，从而影响其结构和功能[8]。植物解除三价砷毒性的途径是合成富含巯基的多肽，如谷胱甘肽和植物络合素与三价砷结合，络合物通过液泡膜上的蛋白进入液泡而被区室化，使三价砷不能与具有一定功能的蛋白质结合而失去毒性。
因此，在五价砷植物体内代谢的过程中，谷胱甘肽和植物络合素具有重要作用，而它们在植物体内合成涉及到两个重要的基因：GSH1和PCS1。GSH1是负责γ谷氨酰半胱氨酸合成酶催化谷胱甘肽合成的重要基因，该基因突变会导致谷胱甘肽合成量下降，突变体对重金属镉和砷的耐性降低[12]；PCS1是负责植物螯合肽合酶催化植物螯合肽合成的重要基因[13]。cad13是PCS1基因在CAD13位点突变的突变体，cad13突变体内的植物螯合肽含量降低，并且也会对重金属镉、砷的耐性降低。为了了解更多关于植物体内砷的解毒过程，我们对cad13突变体进行诱变，建立突变体库，筛选对五价砷敏感的突变体。在之前的筛选过程中，我们筛选到了1株在cad13突变基础上对五价砷更敏感的突变体ayl1（Sensitive to Arsenate with Yellow Leaf），为了更好地了解该突变基因在五价砷解毒过程中的作用，我们设计了竖板培养、水培毒害、叶绿素含量测定等实验，对突变体的生理表型进行初步分析。
1 材料与方法
1.1 材料
植物材料：拟南芥敏感突变体Col0（野生型）,cad13，ayl1
1.2 实验方法
1.2.1 地上部和根部的表型分析实验 1/2MS培养基的配置：1升1/2MS培养基加入MS培养基粉末 2.37g，蔗糖20g，加入琼脂后，pH至5.5，竖板培养基琼脂浓度为1%，平板琼脂浓度为0.8%，用高压蒸汽灭菌法，121℃灭菌20min。拟南芥种子4℃春化3d后，用8%的次氯酸钠灭菌后，播到五价砷浓度为0、1、2、4、6、8μM 的培养基上。在22℃／14h光照和22℃／8h黑暗培养条件下培养10d。
1.2.2 叶绿素含量测定实验 将在竖板上培养10天的Col0、cad13、ayl1苗拍照，并使用Image J软件对根长进行测定。将地上部剪下来，每取50棵拟南芥的地上部为一个重复，共3个重复，称量鲜重。将称重后的样品在液氮中冷冻研磨打碎，加入400μL 80%丙酮提取液，震荡涡旋后在4℃ 15000rpm转速离心10min。提取上清液至新的离心管，重复上述步骤，其中加入的80%丙酮分步为400μL，1000μL，200μL。最后获得2ml上清液。取100μL加入900μL 80%丙酮至新的离心管稀释10倍之后，使用紫外/可见分光光度计，分别测定样品在470、646.6、663.6nm的吸收值，按照公式计算叶绿素a和叶绿素b的含量：
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