解磷真菌的分离筛选及解磷效果研究
摘要：磷是植物体生长发育所必需的三大元素之一。尽管绝大多数土壤中含有着丰富的磷元素，但因土壤中所含的磷元素易被固定且易形成沉淀，因此土壤中实际能被植物体利用的磷元素很少。我们从不同地区的土壤取样，通过分离解磷真菌,并通过溶磷活性测定和土培实验法研究其解磷效果。在改良PVK培养基涂布筛选解磷真菌D-1、F-1、DK-3，选择解磷效率较高的菌株DK-3进行进一步研究。通过形态观察发现，菌株DK-3分生孢子梗着生在头型的孢子囊上初步鉴定为黑曲霉，我们绘制了黑曲霉DK-3的磷标准曲线，并研究了不同磷源下DK-3的解磷效果。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words1
研究背景1
1 材料与方法3
1.1 土样及培养基3
1.1.1 土壤样本3
1.1.2 培养基3
1.2 解磷真菌分离及初步鉴定4
1.3真菌溶磷活性测定4
1.4钼酸铵分光光度法测定磷标准曲线4
1.5 钼酸铵分光光度法测定培养液中PO43含量4
1.6 土培实验4
1.6.1 土样4
1.6.2 溶磷菌剂制备4
1.6.3 土培方法5
1.6.4 测定指标和方法5
1.7 实验仪器5
2 结果与分析5
2.1解磷真菌筛选5
2.2菌株DK3的初步鉴定5
2.3制备PO43标准曲线6
2.4 黑曲霉DK3在以Ca3(PO4）2为磷源的培养液中的解磷效果6
2.5 黑曲霉DK3在以羟基磷灰石为磷源的培养液中的解磷效果7
2.6土培实验结果7
2.6.1不同处理对土壤有效磷的影响7
3 讨论8
致谢8
参考文献8
解磷真菌的分离筛选及解磷效果研究
环境121 朱诚
引言
研究背景：磷是限制作物生长的第二大营养要素，在磷素供给不理想的状态下，植物将减产515%。一般来说，土壤中含有0.020.5%的总磷
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
，它们大多以难溶性无机磷酸盐的形式存在(主要是磷酸钙、磷酸铝、磷酸铁，在碱性土壤中以磷酸钙为主)，只有1%可被植物利用。
磷是植物细胞的重要组成元素之一，可参加植物的光合作用，且对植物代谢和遗传起到重要作用。在我国，缺磷的现象非常严重占到土壤的74%，在北方，由于盐碱地和钙化土壤较多，可与土壤中的Ca2+结合，形成难溶的无效磷，无法被植物直接吸收利用。而在我国南方地区，由于降雨量充足，水土流失量大，全年日照充足，热量丰富，形成了酸性强，铁铝含量高，土壤易板结的特点，难溶性的磷被铁铝离子所固定，形成难溶性磷酸盐，而可溶性的磷却被雨水所带走，导致了山地土壤磷元素严重缺失，而且水体富磷化严重，再加之农民不科学的施用磷肥，使土壤更加板结加重，通气透水性更差，使得土壤更加缺磷和水体富磷化。?在生产实践中,为了提高作物产量,每年都要向土壤中施入大量可溶性磷肥,然而许多研究表明,磷酸盐在土壤中常以磷酸三钙为主,这类磷酸盐溶解性差,难于被植物所吸收,作物对磷肥的当季的利用率一般只有5%～ 10%,加上作物的后效,也不超过25%。长期施用磷肥导致大多数农田土壤潜在的磷库含量很大,而提供作物生长发育的磷量却很少,所以土壤缺磷是“遗传学缺磷”而非“土壤学缺磷”。因此如何解决这个矛盾,控制滥用肥料带来的环境污染,分离筛选出高效具有解磷作用的微生物菌株并设法制成微肥,成了近些年的微生物学界的研究热点之一。
很多因素影响了土壤磷素的有效利用，然而土壤中存在着一些微生物能够将难溶性的磷酸盐转化为可利用形态,这些微生物称为解磷微生物(phosphatesolubilizingmicroorganisms, PSM)。解磷微生物对土壤中难溶磷酸盐具有巨大的转化能力，能将其分泌为植物生长所需的植物生长素类物质，从而促进植物生长发育。 目前已报到的解磷微生物包括细菌、真菌和放线菌等。其中溶磷细菌的种类和数量较多，但一般认为真菌的解磷能力要强于细菌，可以达到10倍以上，而且许多细菌在进一步的纯化过程中会失去解磷能力，但真菌可以始终保持其解磷能力.解磷微生物能依靠自身的代谢产物或与其它生物协同溶解土壤中的难溶无机磷,从而在磷素[1]转化中起着重要作用.因此解磷微生物的研究一直受到科学家的重视,期望以接种剂的途径提高土壤难溶性磷的有效性和磷肥的利用效率.由于不同种类的解磷菌或菌株之间的解磷能力和接种效果差异悬殊,所以高效解磷菌株的筛选显得尤为重要.研究显示,真菌的解磷能力大于细菌,但在微生物肥料生产中解磷细菌所占比例高于真菌,说明在微生物肥料生产中解磷稳定的高效菌株还比较少,这为优良菌株的选育工作提出了迫切任务.
若用解磷菌作为生物肥料，其优势是显而易见的：成本低，效果好，缓释可持续，施用后不但可以增加作物产量，改善土壤质量和结构，还能提高土壤有机质含量，提高土壤中磷的有效利用率，节肥增产，对保持生态环境平衡具有重要意义。
本文中主要研究的解磷真菌为黑曲霉(Aspergillus niger)。黑曲霉是一种常见的真菌，现黑曲霉，子囊菌亚门，丝孢目，丛梗孢科中的一个常见种。黑曲霉壁厚而光滑，顶部形成球形顶囊，其上全面覆盖一层梗基和一层小梗，小梗上长有成串褐黑色的球状, 直径2.5～4.0μm。分生孢子头球状，直径700～800μm，褐黑色。蔓延迅速，初为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状,背面无色或中央略带黄褐色。顶囊为球形，有双层小梗。黑曲霉是重要的发酵工业菌种。有的菌株还可将羟基孕甾酮转化为雄烯。生长适温37℃，最低相对湿度为88%，能引致水分较高的粮食霉变和其他工业器材霉变。黑曲霉在发酵培养液中产生草酸柠檬酸等多种酸分泌有机酸对难溶性磷化合物进行酸解作用是微生物重要的溶磷机制之一。范丙全等[2]选取了2株具有溶磷作用的草酸青霉菌菌株P8和Pn1。在不同培养条件下测定了它们的溶磷能力, 并与拜莱青霉菌ATCC20851和解磷巨大芽孢杆菌ATCC14581 进行了比较。在固体培养基上草酸青霉菌P8、Pn1表现较强的溶解Ca3(PO4)2、Ca8[H2(PO 4)]65H2O、CaHPO4、FePO4和骨粉的能力。Sundara等利用Ca3(PO4)2作为磷源发现与溶磷细菌的溶磷能力相比虽然溶磷真菌在数量和种类上都少于溶磷细菌但溶磷真菌的溶磷能力一般要强于细菌[1]。得知解磷真菌解磷效果可能比细菌的解磷效果强，这也在农业推广中具有较大的作用。
本实验中有进行解磷真菌解磷能力的测定:分离解磷真菌并测定解磷真菌解磷能力有3种常用方法：将解磷真菌的菌丝体接种到含有难溶性磷酸盐的固体平皿上培养，培养一段时间后测定平板上的菌丝体周围产生的透明带大小;将解磷真菌的菌丝体接种到含有难溶性磷盐的液体培养基中进行摇瓶培养，培养一段时间后对比接种有解磷真菌和没接解磷真菌的液体培养基中可溶性磷含量;将解磷真菌的菌丝体接种到含有培养液的土中或砂中进行培养，其中土培主要是为了测定水溶性磷含量，而沙培主要是为了测定土壤浸提液中有效磷含量。此外，还可以采用其他方法对总磷含量进行测定。
为了使解磷微生物能够更好地为农业服务，利用有效的筛选模型将高效解磷菌株从众多土壤微生物中分离出来，研究其溶磷效果，使各种功能微生物能够充分地发挥作用，具有重要的现实意义。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words1
研究背景1
1 材料与方法3
1.1 土样及培养基3
1.1.1 土壤样本3
1.1.2 培养基3
1.2 解磷真菌分离及初步鉴定4
1.3真菌溶磷活性测定4
1.4钼酸铵分光光度法测定磷标准曲线4
1.5 钼酸铵分光光度法测定培养液中PO43含量4
1.6 土培实验4
1.6.1 土样4
1.6.2 溶磷菌剂制备4
1.6.3 土培方法5
1.6.4 测定指标和方法5
1.7 实验仪器5
2 结果与分析5
2.1解磷真菌筛选5
2.2菌株DK3的初步鉴定5
2.3制备PO43标准曲线6
2.4 黑曲霉DK3在以Ca3(PO4）2为磷源的培养液中的解磷效果6
2.5 黑曲霉DK3在以羟基磷灰石为磷源的培养液中的解磷效果7
2.6土培实验结果7
2.6.1不同处理对土壤有效磷的影响7
3 讨论8
致谢8
参考文献8
解磷真菌的分离筛选及解磷效果研究
环境121 朱诚
引言
研究背景：磷是限制作物生长的第二大营养要素，在磷素供给不理想的状态下，植物将减产515%。一般来说，土壤中含有0.020.5%的总磷
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
，它们大多以难溶性无机磷酸盐的形式存在(主要是磷酸钙、磷酸铝、磷酸铁，在碱性土壤中以磷酸钙为主)，只有1%可被植物利用。
磷是植物细胞的重要组成元素之一，可参加植物的光合作用，且对植物代谢和遗传起到重要作用。在我国，缺磷的现象非常严重占到土壤的74%，在北方，由于盐碱地和钙化土壤较多，可与土壤中的Ca2+结合，形成难溶的无效磷，无法被植物直接吸收利用。而在我国南方地区，由于降雨量充足，水土流失量大，全年日照充足，热量丰富，形成了酸性强，铁铝含量高，土壤易板结的特点，难溶性的磷被铁铝离子所固定，形成难溶性磷酸盐，而可溶性的磷却被雨水所带走，导致了山地土壤磷元素严重缺失，而且水体富磷化严重，再加之农民不科学的施用磷肥，使土壤更加板结加重，通气透水性更差，使得土壤更加缺磷和水体富磷化。?在生产实践中,为了提高作物产量,每年都要向土壤中施入大量可溶性磷肥,然而许多研究表明,磷酸盐在土壤中常以磷酸三钙为主,这类磷酸盐溶解性差,难于被植物所吸收,作物对磷肥的当季的利用率一般只有5%～ 10%,加上作物的后效,也不超过25%。长期施用磷肥导致大多数农田土壤潜在的磷库含量很大,而提供作物生长发育的磷量却很少,所以土壤缺磷是“遗传学缺磷”而非“土壤学缺磷”。因此如何解决这个矛盾,控制滥用肥料带来的环境污染,分离筛选出高效具有解磷作用的微生物菌株并设法制成微肥,成了近些年的微生物学界的研究热点之一。
很多因素影响了土壤磷素的有效利用，然而土壤中存在着一些微生物能够将难溶性的磷酸盐转化为可利用形态,这些微生物称为解磷微生物(phosphatesolubilizingmicroorganisms, PSM)。解磷微生物对土壤中难溶磷酸盐具有巨大的转化能力，能将其分泌为植物生长所需的植物生长素类物质，从而促进植物生长发育。 目前已报到的解磷微生物包括细菌、真菌和放线菌等。其中溶磷细菌的种类和数量较多，但一般认为真菌的解磷能力要强于细菌，可以达到10倍以上，而且许多细菌在进一步的纯化过程中会失去解磷能力，但真菌可以始终保持其解磷能力.解磷微生物能依靠自身的代谢产物或与其它生物协同溶解土壤中的难溶无机磷,从而在磷素[1]转化中起着重要作用.因此解磷微生物的研究一直受到科学家的重视,期望以接种剂的途径提高土壤难溶性磷的有效性和磷肥的利用效率.由于不同种类的解磷菌或菌株之间的解磷能力和接种效果差异悬殊,所以高效解磷菌株的筛选显得尤为重要.研究显示,真菌的解磷能力大于细菌,但在微生物肥料生产中解磷细菌所占比例高于真菌,说明在微生物肥料生产中解磷稳定的高效菌株还比较少,这为优良菌株的选育工作提出了迫切任务.
若用解磷菌作为生物肥料，其优势是显而易见的：成本低，效果好，缓释可持续，施用后不但可以增加作物产量，改善土壤质量和结构，还能提高土壤有机质含量，提高土壤中磷的有效利用率，节肥增产，对保持生态环境平衡具有重要意义。
本文中主要研究的解磷真菌为黑曲霉(Aspergillus niger)。黑曲霉是一种常见的真菌，现黑曲霉，子囊菌亚门，丝孢目，丛梗孢科中的一个常见种。黑曲霉壁厚而光滑，顶部形成球形顶囊，其上全面覆盖一层梗基和一层小梗，小梗上长有成串褐黑色的球状, 直径2.5～4.0μm。分生孢子头球状，直径700～800μm，褐黑色。蔓延迅速，初为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状,背面无色或中央略带黄褐色。顶囊为球形，有双层小梗。黑曲霉是重要的发酵工业菌种。有的菌株还可将羟基孕甾酮转化为雄烯。生长适温37℃，最低相对湿度为88%，能引致水分较高的粮食霉变和其他工业器材霉变。黑曲霉在发酵培养液中产生草酸柠檬酸等多种酸分泌有机酸对难溶性磷化合物进行酸解作用是微生物重要的溶磷机制之一。范丙全等[2]选取了2株具有溶磷作用的草酸青霉菌菌株P8和Pn1。在不同培养条件下测定了它们的溶磷能力, 并与拜莱青霉菌ATCC20851和解磷巨大芽孢杆菌ATCC14581 进行了比较。在固体培养基上草酸青霉菌P8、Pn1表现较强的溶解Ca3(PO4)2、Ca8[H2(PO 4)]65H2O、CaHPO4、FePO4和骨粉的能力。Sundara等利用Ca3(PO4)2作为磷源发现与溶磷细菌的溶磷能力相比虽然溶磷真菌在数量和种类上都少于溶磷细菌但溶磷真菌的溶磷能力一般要强于细菌[1]。得知解磷真菌解磷效果可能比细菌的解磷效果强，这也在农业推广中具有较大的作用。
本实验中有进行解磷真菌解磷能力的测定:分离解磷真菌并测定解磷真菌解磷能力有3种常用方法：将解磷真菌的菌丝体接种到含有难溶性磷酸盐的固体平皿上培养，培养一段时间后测定平板上的菌丝体周围产生的透明带大小;将解磷真菌的菌丝体接种到含有难溶性磷盐的液体培养基中进行摇瓶培养，培养一段时间后对比接种有解磷真菌和没接解磷真菌的液体培养基中可溶性磷含量;将解磷真菌的菌丝体接种到含有培养液的土中或砂中进行培养，其中土培主要是为了测定水溶性磷含量，而沙培主要是为了测定土壤浸提液中有效磷含量。此外，还可以采用其他方法对总磷含量进行测定。
为了使解磷微生物能够更好地为农业服务，利用有效的筛选模型将高效解磷菌株从众多土壤微生物中分离出来，研究其溶磷效果，使各种功能微生物能够充分地发挥作用，具有重要的现实意义。
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