秸秆生物反应堆菌剂的筛选与应用
摘要：本试验以水稻、小麦、玉米秸秆以及土壤样品为材料，通过富集培养、筛选及纯化等过程，从中分离筛选出高效秸秆腐解菌9株（X-1、X-3、X-5、Z-6、Z-8、Z-10、F-3、F-4、F-5），并完成对其纤维素酶相对活性、秸秆失重率（DR）、滤纸酶活（FPA）、纤维素内切酶活（CMCase）和半纤维素酶活（Xylanase）的测定。结果表明，各菌株在液体摇瓶条件下7 d内对秸秆的腐解率在10%~42%之间。腐解效果明显的5株菌经鉴定分别为Bacillus amyloliquefaciens（解淀粉芽孢杆菌）、Bacillus（芽孢杆菌）、Paenibacillus（类芽孢杆菌）、Ganoderma camosum（灵芝）和Penicillium oxalicum（草酸青霉）。从上述5株腐解菌中挑选对秸秆腐解效果较好的细菌X-3和真菌Z-8组成复合菌剂，比较复合菌剂与单一菌株的滤纸酶活、纤维素内切酶活、半纤维素酶活以及对秸秆降解率，研究发现复配菌剂产酶高于单一菌株，其在14 d内对秸秆腐解率达到68%。本研究结果表明复合菌剂与单一菌株相比可以更好地应用于秸秆生物反应堆。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words 3
引言3
1 材料与方法4
1.1 材料4
1.1.1 实验样品4
1.1.2 培养基4
1.2 方法4
1.2.1 富集培养4
1.2.2 初筛及纯化4
1.2.3 复筛4
1.2.4 纤维素酶相对活性测定4
1.2.5 秸秆失重测定4
1.2.6 DNS试剂法酶活测定5
1.2.7 高效秸秆腐解细菌的形态学观察及革兰氏染色5
1.2.8 16S rDNA鉴定5
1.2.9 18S rDNA鉴定6
1.2.10 高效秸秆腐解菌复配 6
1.2.11 复合菌剂腐解效果的验证 6
2 结果与分析6
2.1 高效秸秆腐解菌的初筛及纯化6
2.2 复筛7
2.3 单一菌株酶活测定8
/> 2.4 菌株鉴定8
2.4.1 菌株形态观察8
2.4.2 16S和18S rDNA基因测序分析9
2.5 复配菌剂秸秆失重率测定12
2.6 复配菌剂酶活测定12
3 讨论14
3.1 菌株的分离和筛选14
3.2 菌株酶活的测定14
3.3 高效秸秆腐解菌的鉴定14
3.4 菌种系统发育树的构建15
致谢 15
参考文献 15
秸秆生物反应堆菌剂的筛选与应用
引言
引言
纤维素类物质（秸秆）是自然界中存在最丰富、最廉价的一类碳水化合物[l]。据估计，全世界每年纤维素通过光合作用的更新量约为4.0×109 t，它们是自然界中存在量最大的一类可再生资源，也是数量最大的一类环境污染物[2, 3]。我国是农业大国，年产各种农作物秸秆约8.0亿t以上，占世界秸秆总产量的20%~30%[4]。由于秸秆木质纤维素中存在许多高能氢键且结晶度高，其水解、利用较困难，目前只利用了其中很小的一部分，大部分作为废弃物被丢弃焚烧，不仅浪费了宝贵的物质资源，也引起严重的环境问题[57]。随着经济的发展和城乡人民生活水平的提高，秸秆的综合利用率逐年下降。因此大量过剩的秸秆找到一条适当的利用途径是农业生产的迫切需要解决的问题。
本研究采用以秸秆粉为唯一碳源的无机盐培养液富集高效分解菌，利用在刚果红纤维素培养基产生水解圈进行初筛，秸秆失重率做为复筛标准，获得多株高效腐解菌株，通过生理生化和分子手段对菌种进行鉴定。研究不同菌株之间的亲和性，最终复配成不同类型的秸秆腐解菌剂，并在已有的秸秆生物反应堆技术中运用，以加速秸秆分解和促进作物生长，充分发挥秸秆资源的潜力，减少燃烧秸秆造成的环境污染。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 实验样品
水稻秸秆、小麦秸秆、玉米秸秆、土壤样品。
1．1．2 培养基
无机盐培养基：NaCl 1.0 g，KH2PO4 0.5 g，K2HPO4 1.5 g，MgSO47H2O 0.2 g，(NH4)2SO4 1.0 g，pH 7.0~7.2，加入秸秆样品做为唯一碳源（1~2%）。
刚果红纤维素培养基：纤维素粉 1.88 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO47H2O 0.25 g，琼脂 30 g，明胶 2.0 g，刚果红 2.0 g。
PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂3%，加超纯水定容至1000 mL，pH 自然。
LB培养基：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，加超纯水定容至1000 mL，pH 7.0~7.2。
高氏一号培养基：可溶性淀粉 20 g，KNO3 1.0 g，NaCl 0.5 g，K2HPO43H2O 0.5 g，MgSO47H2O 0.5 g，FeSO47H2O 0.01 g，琼脂20 g，加超纯水定容至1000 mL，pH 7.4~7.6。
羧甲基纤维素培养基：CMC 10 g，KH2PO4 2.0 g，(NH4)2SO4 4.0 g，MgSO47H2O 0.5 g，蛋白胨 10 g，琼脂 25 g，水 1000 mL，pH 7.0~7.2。
产纤维素酶培养基：Na2HPO412H2O 1.58 g，KH2PO4 0.9 g，NaNO3 1.0 g，KCl 0.5 g，MgSO47H2O 0.5 g，酵母提取物 0.5 g，水解酪蛋白 0.5 g，纤维素粉 0.2%，pH 7.0~7.2。
1．2 方法
1．2．1 富集培养
用500 mL三角瓶配制无机盐培养液，加入未作处理的秸秆样品（秸秆样品作为唯一碳源），将土壤样品制成悬液加入三角瓶中，放到30 ℃ 130 r/m的摇床培养7 d，观察秸秆腐解情况，选取秸秆腐解明显的三角瓶作为下一步研究对象。
1．2．2 初筛及纯化
从已选的三角瓶中吸取悬液1 mL，进行101~106浓度梯度稀释，然后取0.05 mL分别涂布到刚果红纤维素平板上，30 ℃温箱培养5 d，观察水解圈[8]。透明圈效果明显的菌体分别在PDA、LB、高氏一号培养基上进行培养，挑出显著的菌落，用接种针将菌落回接到三种培养基上进行多次划线分离，得到纯菌株。将纯化所得单菌株回接到刚果红纤维素平板上培养，选取依然产生水解圈的菌株[9]。
1．2．3 复筛
向装有无机盐营养液的三角瓶中加入0.5 g秸秆，接入在刚果红纤维素平板上分解效果明显的菌体，30 ℃温箱培养。每隔7 d进行秸秆失重测定，筛选出腐解秸秆效率高的菌株。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words 3
引言3
1 材料与方法4
1.1 材料4
1.1.1 实验样品4
1.1.2 培养基4
1.2 方法4
1.2.1 富集培养4
1.2.2 初筛及纯化4
1.2.3 复筛4
1.2.4 纤维素酶相对活性测定4
1.2.5 秸秆失重测定4
1.2.6 DNS试剂法酶活测定5
1.2.7 高效秸秆腐解细菌的形态学观察及革兰氏染色5
1.2.8 16S rDNA鉴定5
1.2.9 18S rDNA鉴定6
1.2.10 高效秸秆腐解菌复配 6
1.2.11 复合菌剂腐解效果的验证 6
2 结果与分析6
2.1 高效秸秆腐解菌的初筛及纯化6
2.2 复筛7
2.3 单一菌株酶活测定8
/> 2.4 菌株鉴定8
2.4.1 菌株形态观察8
2.4.2 16S和18S rDNA基因测序分析9
2.5 复配菌剂秸秆失重率测定12
2.6 复配菌剂酶活测定12
3 讨论14
3.1 菌株的分离和筛选14
3.2 菌株酶活的测定14
3.3 高效秸秆腐解菌的鉴定14
3.4 菌种系统发育树的构建15
致谢 15
参考文献 15
秸秆生物反应堆菌剂的筛选与应用
引言
引言
纤维素类物质（秸秆）是自然界中存在最丰富、最廉价的一类碳水化合物[l]。据估计，全世界每年纤维素通过光合作用的更新量约为4.0×109 t，它们是自然界中存在量最大的一类可再生资源，也是数量最大的一类环境污染物[2, 3]。我国是农业大国，年产各种农作物秸秆约8.0亿t以上，占世界秸秆总产量的20%~30%[4]。由于秸秆木质纤维素中存在许多高能氢键且结晶度高，其水解、利用较困难，目前只利用了其中很小的一部分，大部分作为废弃物被丢弃焚烧，不仅浪费了宝贵的物质资源，也引起严重的环境问题[57]。随着经济的发展和城乡人民生活水平的提高，秸秆的综合利用率逐年下降。因此大量过剩的秸秆找到一条适当的利用途径是农业生产的迫切需要解决的问题。
本研究采用以秸秆粉为唯一碳源的无机盐培养液富集高效分解菌，利用在刚果红纤维素培养基产生水解圈进行初筛，秸秆失重率做为复筛标准，获得多株高效腐解菌株，通过生理生化和分子手段对菌种进行鉴定。研究不同菌株之间的亲和性，最终复配成不同类型的秸秆腐解菌剂，并在已有的秸秆生物反应堆技术中运用，以加速秸秆分解和促进作物生长，充分发挥秸秆资源的潜力，减少燃烧秸秆造成的环境污染。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 实验样品
水稻秸秆、小麦秸秆、玉米秸秆、土壤样品。
1．1．2 培养基
无机盐培养基：NaCl 1.0 g，KH2PO4 0.5 g，K2HPO4 1.5 g，MgSO47H2O 0.2 g，(NH4)2SO4 1.0 g，pH 7.0~7.2，加入秸秆样品做为唯一碳源（1~2%）。
刚果红纤维素培养基：纤维素粉 1.88 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO47H2O 0.25 g，琼脂 30 g，明胶 2.0 g，刚果红 2.0 g。
PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂3%，加超纯水定容至1000 mL，pH 自然。
LB培养基：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，加超纯水定容至1000 mL，pH 7.0~7.2。
高氏一号培养基：可溶性淀粉 20 g，KNO3 1.0 g，NaCl 0.5 g，K2HPO43H2O 0.5 g，MgSO47H2O 0.5 g，FeSO47H2O 0.01 g，琼脂20 g，加超纯水定容至1000 mL，pH 7.4~7.6。
羧甲基纤维素培养基：CMC 10 g，KH2PO4 2.0 g，(NH4)2SO4 4.0 g，MgSO47H2O 0.5 g，蛋白胨 10 g，琼脂 25 g，水 1000 mL，pH 7.0~7.2。
产纤维素酶培养基：Na2HPO412H2O 1.58 g，KH2PO4 0.9 g，NaNO3 1.0 g，KCl 0.5 g，MgSO47H2O 0.5 g，酵母提取物 0.5 g，水解酪蛋白 0.5 g，纤维素粉 0.2%，pH 7.0~7.2。
1．2 方法
1．2．1 富集培养
用500 mL三角瓶配制无机盐培养液，加入未作处理的秸秆样品（秸秆样品作为唯一碳源），将土壤样品制成悬液加入三角瓶中，放到30 ℃ 130 r/m的摇床培养7 d，观察秸秆腐解情况，选取秸秆腐解明显的三角瓶作为下一步研究对象。
1．2．2 初筛及纯化
从已选的三角瓶中吸取悬液1 mL，进行101~106浓度梯度稀释，然后取0.05 mL分别涂布到刚果红纤维素平板上，30 ℃温箱培养5 d，观察水解圈[8]。透明圈效果明显的菌体分别在PDA、LB、高氏一号培养基上进行培养，挑出显著的菌落，用接种针将菌落回接到三种培养基上进行多次划线分离，得到纯菌株。将纯化所得单菌株回接到刚果红纤维素平板上培养，选取依然产生水解圈的菌株[9]。
1．2．3 复筛
向装有无机盐营养液的三角瓶中加入0.5 g秸秆，接入在刚果红纤维素平板上分解效果明显的菌体，30 ℃温箱培养。每隔7 d进行秸秆失重测定，筛选出腐解秸秆效率高的菌株。
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