污泥中多重抗生素耐药菌的分离及鉴定
滥用抗生素导致了大量耐药细菌(ARB)和抗性基因(ARGs)形成，这些细菌和基因可以在不同的环境介质中传播，严重威胁环境安全与人类健康。污水处理厂是ARB和ARGs的储存库，同时也是它们传播的重要途径。本文以污水处理厂活性污泥为样本，从中筛选出多重抗生素耐药菌，进行16S rRNA基因测序，构建系统进化树。结合宏基因组检测，综合判定耐药菌的种类和抗性基因的分类及抗性基因物种归属。目的菌株鉴定结果为恶臭假单胞菌，其携带的抗性基因主要有aac3iia、ant2ia、cata8、ermb、teta、vatd等34种。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1.1 材料与仪器 2
1.1.1 材料 2
1.1.2 主要试剂 3
1.1.3 主要仪器 3
1.2 耐药菌初筛 3
1.2.1 样品预处理 3
1.2.2 抗生素培养基的配制 3
1.2.3 分离纯化耐药菌 3
1.3 药敏试验 3
1.4 16S rRNA基因测序鉴定菌种 3
1.4.1 DNA提取 3
1.4.2 PCR扩增 3
1.4.3 基因测序 4
1.4.4 序列比对 4
1.4.5 构建系统进化树 4
1.5 宏基因组检测 4
2 结果与讨论 4
2.1 多重耐药菌分离 4
2.2 抗生素敏感性分析 5
2.3 多重耐药菌鉴定 7
2.4 系统进化树生成 7
2.5 抗性基因的鉴定与分类 9
3 结论 10
致谢 11
参考文献 11
污泥中多重抗生素耐药菌的分离及鉴定
引言
随着人们生活水平的提高，每年都有大量的抗生素经人畜排泄进入自然环境中[1]。用于治疗的抗生素可以杀死或抑制病原体，但它们也可以杀死或抑制其他微生物。这种不加区别的药物作用破坏了易感细菌和抗生素耐药菌之间的平衡 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
，诱导出大量的抗生素耐药菌(ARB)和抗生素抗性基因(ARGs)，并在环境筛选过程中形成多重抗生素耐药菌。作为一种新型环境污染物[2]，ARGs可以轻易转移、扩散到环境中，危害程度远大于抗生素[3]。目前，抗生素耐药菌和抗性基因已广泛分布于水体、土壤等各类环境中，且与自然环境相比，人工环境中的ARGs检出率更高[4]，城市污水处理厂作为典型的人工环境最具代表性。ARB与ARGs通过不同途径汇聚到城市污水处理厂，污水厂中丰富的营养物质以及高密度的微生物为ARB与ARGs的富集、传播提供了有利条件[5]，若处理不当，它们将以污水排放、污泥综合利用等方式进入自然水体和土壤[6]。因此，WWTPs可被看作是抗生素耐药菌和抗性基因的储存库[78]，同时也是它们进行传播的重要途径。在污水处理厂中使用合适的处理方法来高效、集中地去除抗生素抗性基因对于有效控制其传播扩散是非常重要的。
已有大量学者对污水处理厂水体中的ARB和ARGs进行研究，UV消毒、O3消毒和氯消毒是最为常见的去除方法，但研究结果显示其去除效果往往不够理想且具有特异性[6]，而关于活性污泥中的耐药菌和抗性基因的研究相对较少。在污水处理过程中，活性污泥吸附、富集了大量ARB和ARGs，其数量和种类远高于出水，且由于污泥在处置与利用环节不够规范，ARB与ARGs通过污泥输入环境的贡献值远高于通过污水处理厂的出水[9]。在这种情形下，深入研究污水处理厂活性污泥中的ARB和ARGs显得尤为重要。恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)为广泛分布在环境中的革兰氏阴性菌，它也往往分布在富集了大量微生物的活性污泥中，其在自然环境中参与了重要的代谢活动，包括元素循环、生物降解和修复外源污染等。该菌属的Pseudomonas putida KT 2440是第一株经重组DNA咨询委员会(recombinant DNA advisory committee)认证为安全无害的革兰氏阴性土壤细菌[10]。因此，目前看来恶臭假单胞菌不存在危害及风险，甚至对生态环境有益，但对于污水处理厂污泥中的恶臭假单胞菌仍需进一步探究。
为深入了解污泥中ARGs的种类及分布情况，采用分子生物学相关技术进行探究。16S rRNA基因测序技术有灵敏度较高、检测能力较强、检测时间较短、不被抗生素影响以及可能发现新菌种[11]等优势，目前在菌种鉴定中已得到广泛应用[12]。编码16S rRNA的16S rDNA序列分为可变区域和保守区域，菌种间的差别在可变区域体现，而菌种间的亲缘关系则在保守区域得到展示。鉴定通过将模板DNA进行PCR扩增，而后用基因测序仪测得目标DNA序列，最后将DNA序列在NCBI数据库中与近似序列相比较，通过同源性分析鉴定细菌属种。当下，宏基因组测序技术也作为一类新型分子生物学技术进入人们的视野，给微生物方向的研究带来更多可能[13]。本试验中，运用该技术进行抗性基因检测分类和抗性基因物种归属研究，这对了解多重耐药菌及其抗性基因的危害有着重大意义。
本课题以污水处理厂中活性污泥为样本，将从所有污泥微生物中分离、筛选出多重抗生素耐药菌进行16S rRNA基因测序，鉴定其菌种，并和其亲缘关系相近的微生物构建系统进化树，而后进行宏基因组测序，对其抗性基因进行分类探究，总结多重耐药菌株所含有的抗性基因类别及功能。此研究不仅有助于了解活性污泥中ARB的环境学地位及其生态影响，也为在废水处理厂中探索一种新型ARGs去除方法奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料
芦村污水处理厂的二沉池活性污泥、太湖新城污水处理厂的二沉池活性污泥。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1.1 材料与仪器 2
1.1.1 材料 2
1.1.2 主要试剂 3
1.1.3 主要仪器 3
1.2 耐药菌初筛 3
1.2.1 样品预处理 3
1.2.2 抗生素培养基的配制 3
1.2.3 分离纯化耐药菌 3
1.3 药敏试验 3
1.4 16S rRNA基因测序鉴定菌种 3
1.4.1 DNA提取 3
1.4.2 PCR扩增 3
1.4.3 基因测序 4
1.4.4 序列比对 4
1.4.5 构建系统进化树 4
1.5 宏基因组检测 4
2 结果与讨论 4
2.1 多重耐药菌分离 4
2.2 抗生素敏感性分析 5
2.3 多重耐药菌鉴定 7
2.4 系统进化树生成 7
2.5 抗性基因的鉴定与分类 9
3 结论 10
致谢 11
参考文献 11
污泥中多重抗生素耐药菌的分离及鉴定
引言
随着人们生活水平的提高，每年都有大量的抗生素经人畜排泄进入自然环境中[1]。用于治疗的抗生素可以杀死或抑制病原体，但它们也可以杀死或抑制其他微生物。这种不加区别的药物作用破坏了易感细菌和抗生素耐药菌之间的平衡 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
，诱导出大量的抗生素耐药菌(ARB)和抗生素抗性基因(ARGs)，并在环境筛选过程中形成多重抗生素耐药菌。作为一种新型环境污染物[2]，ARGs可以轻易转移、扩散到环境中，危害程度远大于抗生素[3]。目前，抗生素耐药菌和抗性基因已广泛分布于水体、土壤等各类环境中，且与自然环境相比，人工环境中的ARGs检出率更高[4]，城市污水处理厂作为典型的人工环境最具代表性。ARB与ARGs通过不同途径汇聚到城市污水处理厂，污水厂中丰富的营养物质以及高密度的微生物为ARB与ARGs的富集、传播提供了有利条件[5]，若处理不当，它们将以污水排放、污泥综合利用等方式进入自然水体和土壤[6]。因此，WWTPs可被看作是抗生素耐药菌和抗性基因的储存库[78]，同时也是它们进行传播的重要途径。在污水处理厂中使用合适的处理方法来高效、集中地去除抗生素抗性基因对于有效控制其传播扩散是非常重要的。
已有大量学者对污水处理厂水体中的ARB和ARGs进行研究，UV消毒、O3消毒和氯消毒是最为常见的去除方法，但研究结果显示其去除效果往往不够理想且具有特异性[6]，而关于活性污泥中的耐药菌和抗性基因的研究相对较少。在污水处理过程中，活性污泥吸附、富集了大量ARB和ARGs，其数量和种类远高于出水，且由于污泥在处置与利用环节不够规范，ARB与ARGs通过污泥输入环境的贡献值远高于通过污水处理厂的出水[9]。在这种情形下，深入研究污水处理厂活性污泥中的ARB和ARGs显得尤为重要。恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)为广泛分布在环境中的革兰氏阴性菌，它也往往分布在富集了大量微生物的活性污泥中，其在自然环境中参与了重要的代谢活动，包括元素循环、生物降解和修复外源污染等。该菌属的Pseudomonas putida KT 2440是第一株经重组DNA咨询委员会(recombinant DNA advisory committee)认证为安全无害的革兰氏阴性土壤细菌[10]。因此，目前看来恶臭假单胞菌不存在危害及风险，甚至对生态环境有益，但对于污水处理厂污泥中的恶臭假单胞菌仍需进一步探究。
为深入了解污泥中ARGs的种类及分布情况，采用分子生物学相关技术进行探究。16S rRNA基因测序技术有灵敏度较高、检测能力较强、检测时间较短、不被抗生素影响以及可能发现新菌种[11]等优势，目前在菌种鉴定中已得到广泛应用[12]。编码16S rRNA的16S rDNA序列分为可变区域和保守区域，菌种间的差别在可变区域体现，而菌种间的亲缘关系则在保守区域得到展示。鉴定通过将模板DNA进行PCR扩增，而后用基因测序仪测得目标DNA序列，最后将DNA序列在NCBI数据库中与近似序列相比较，通过同源性分析鉴定细菌属种。当下，宏基因组测序技术也作为一类新型分子生物学技术进入人们的视野，给微生物方向的研究带来更多可能[13]。本试验中，运用该技术进行抗性基因检测分类和抗性基因物种归属研究，这对了解多重耐药菌及其抗性基因的危害有着重大意义。
本课题以污水处理厂中活性污泥为样本，将从所有污泥微生物中分离、筛选出多重抗生素耐药菌进行16S rRNA基因测序，鉴定其菌种，并和其亲缘关系相近的微生物构建系统进化树，而后进行宏基因组测序，对其抗性基因进行分类探究，总结多重耐药菌株所含有的抗性基因类别及功能。此研究不仅有助于了解活性污泥中ARB的环境学地位及其生态影响，也为在废水处理厂中探索一种新型ARGs去除方法奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料
芦村污水处理厂的二沉池活性污泥、太湖新城污水处理厂的二沉池活性污泥。
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