抑病型土壤中的微生物群落诱导香蕉植物抗病基因表达特性研究
摘要：香蕉是世界热带、亚热带地区的重要经济作物，香蕉枯萎病是由一种专化型尖孢镰刀菌引起的土传病害，该病菌对香蕉产业造成了严重的影响。通过调查得知，海南香蕉主产区有连作多年而土传枯萎病发病率较低的蕉园，其土壤为香蕉抑病型土壤。本实验拟通过比较种植于香蕉抑病型土壤悬液（S）和导病型土壤悬液（C）中植株自身抗性基因的表达量，分析抑病型土壤中的微生物群落诱导香蕉抗性基因表达的效应；并结合高通量测序分析抑病型和导病型土壤中微生物区系的差异，解析抑病型土壤抑制香蕉枯萎病爆发的机制。结果表明：香蕉在种植到抑病和导病土壤悬液中后，均能通过与香蕉互作使枯萎病病原菌定殖数量下降，但是抑病土壤悬液处理的病原菌定殖数量下降效应比导病土壤悬液更加明显；两种土壤均能诱导抗性基因表达，但是抗性基因的表达规律不同，前期，导病土壤诱导的抗性基因表达量高于抑病土壤，但这种效应并不持久。本研究不足的是，只研究了香蕉叶片抗性基因的表达量，但是也为我们探究抑病型土壤中的微生物抑制香蕉枯萎病发生提供了一定的依据。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words3
引言3
1材料与方法3
1.1实验材料 3
1.1.1供试作物3
1.1.2供试土壤3
1.1.3供试菌株4
1.1.4供试培养基4
1.1.5仪器4
1.2实验方法 4
1.2.1土壤微生物区系测定4
1.2.2霍格兰营养液制备4
1.2.3土壤悬液制备4
1.2.4病原菌孢子悬液制备5
1.2.3土壤悬液制备5
1.2.4病原菌孢子悬液制备5
1.2.5病原菌定殖实验5
1.2.6香蕉抗性基因的研究5
1.3数据统计与分析7
2 结果与分析7
2.1土壤微生物区系分析7
2.2不同土壤微生物群落与植物互作后对病原菌定值影响 7
2.3不同土壤微生物群落对香蕉抗性基因影响8
3讨论 9
致谢10
参考文献11
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
附录A 论文发表13
附录B 专利申请情况13
抑病型土壤中的微生物群落诱导香蕉植物抗病基因表达特性研究
引言
引言：香蕉是世界热带、亚热带地区的重要经济作物。近年来，随着香蕉的种植规模日益扩大，各类香蕉病虫害日益严重，严重威胁了香蕉产业的发展，其中香蕉枯萎病对香蕉产业的威胁最为严重[1]。自20世纪90年代初，东南亚地区发现4号小种侵染“卡文迪许”（香蕉品种）引起的香蕉枯萎病以来[23]，中国、澳洲、马来西亚、印度尼西亚、约旦、菲律宾、莫桑比克等国家均发现此病。香蕉枯萎病已严重威胁世界“卡文迪许”品种香蕉的生产[45]。
香蕉在中国的亚热带地区广泛栽培食用。虽然我国香蕉栽培面积从上个世纪70年代的0.46万公顷增长到了21世纪10年代的29.6万公顷，但是自从上世纪90年代之后，我国香蕉的栽培面积呈现明显的递减增长，特别是2008年以后，香蕉原产地珠江三角洲地区，因枯萎病发严重而导致香蕉园荒废的情况越来越多[6]。根据不完全统计，在海南、广东等主要香蕉栽培区，香蕉枯萎病的影响面积已经多达18 万公顷[7]，香蕉产区发病的香蕉园病株率为10%～40%, 严重的达90%以上[8]，2013 年海南的香蕉栽培面积相对2010年已减少接近50%[9]。
我国香蕉主产区90%以上的栽培品种为“卡文迪许”[10]。因香蕉种植利润高且稳定，我国大部分蕉园实行单一连作模式，导致土壤微生物区系失衡。据报道，2007年，珠江三角洲香蕉产区新蕉园，香蕉枯萎病的发病率16% 左右，老蕉园的发病率在90%以上[11]。由于农民对于香蕉枯萎病了解较少，其对香蕉枯萎病的防控不当，导致此病害迅速蔓延[6]，已严重威胁我国香蕉产业发展。
已有研究表明香蕉枯萎病病原菌有4个生理小种，不同生理小种的致病性差异较大[5]。樊小林等人的研究，表明施用碱性肥料能防控香蕉枯萎病，其机理主要是提高土壤中的PH值以抑制病原菌的生长，但其研究并未表明此种方法能从根本上长久地抑制香蕉枯萎病病原菌的生长[10]。
通过前期调查得知，海南香蕉主产区有连作多年而土传枯萎病发病率较低的蕉园，其土壤为香蕉抑病型土壤[12]。但是，现有研究并未能够搞清抑制香蕉土传枯萎病土壤的根际微生物区系的特征，以及这些微生物群落如何诱导香蕉应对病原菌入侵，现阶段，国内外主要研究热点主要集中在单个拮抗菌对植物的诱导抗性研究，Ryu等研究发现B. subtilis GB03和B.amyloquefaciens IN937a分泌的挥发性有机物，能够诱导拟南芥幼苗抵御软腐病原菌Erwinia carotovora sub sp. Carotovora[13]；枯草芽孢杆菌GB03能够诱导植物抗病体系防治黄瓜花叶病毒[14]；蜡状芽孢杆菌AR156能激发拟南芥中的水杨酸循环和茉莉酸/乙酸循环诱导PR基因表达来抵御丁香假单胞菌的侵袭[15]。
但是在生态系统中，微生物群落是一个整体，加上香蕉枯萎病是否发生，除受致病菌生理小种和香蕉植株本身的抗性影响外，还受环境条件诸如土壤温度、湿度、土壤中病原菌数量等因素的制约[16]。单个拮抗菌在整个复杂的土壤环境里发挥的效果有待考证。而研究整个的微生物群落对植物抗病性的影响意义会更大。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 供试作物
香蕉苗：巴西香牙蕉（Musa AAA Cavendish cv. Brazil），由海南省万钟实业有限公司组培厂提供。
1．1．2 供试土壤
水培实验所用抑病和导病土壤来自海南天地人生态农业股份有限公司香蕉连作地块，抑病土壤基本理化性质为：pH6.45，总氮1.63 g/kg，总碳16.54 g/kg，铵态氮（NH4+N）1.07 mg/kg，硝态氮（NO3N）1.51 mg/kg，速效磷204 mg/kg，速效钾582 mg/kg。导病土壤基本理化性质：pH为5.44，总氮1.46 g/kg，总碳14.90 g/kg，铵态氮（NH4+N）1.19 mg/kg，硝态氮（NO3N）2.26 mg/kg，1.51速效磷102 mg/kg，速效钾341mg/kg。
1．1．3 供试菌株
本实验所用菌株是含潮霉素抗性基因的香蕉枯萎病病原菌，以下简称RFOC，由本实验室师兄构建（未发表）。
1．1．4 供试培养基和试剂
PDA培养基：去皮的马铃薯200g，切成12 cm小块，煮沸20 min后用纱布过滤，取滤出液，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容到1L，pH自然，115℃高压蒸汽灭菌30min。
马丁氏培养基（即孟加拉红培养基）：蛋白胨5g、葡萄糖10g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁(MgSO47H2O) 0.5g、琼脂20g、1/3000孟加拉红溶液100 mL，去离子水1L，121℃灭菌20 min。
植物RNA提取试剂盒 Aidlab EASY spin Plus Plant RNA；反转录试剂盒Vazyme HiScript II Q RT SuperMix for qPCR；荧光定量PCR试剂盒 TaKaRa SYBR Premix Ex Taq
1．1．5 仪器
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words3
引言3
1材料与方法3
1.1实验材料 3
1.1.1供试作物3
1.1.2供试土壤3
1.1.3供试菌株4
1.1.4供试培养基4
1.1.5仪器4
1.2实验方法 4
1.2.1土壤微生物区系测定4
1.2.2霍格兰营养液制备4
1.2.3土壤悬液制备4
1.2.4病原菌孢子悬液制备5
1.2.3土壤悬液制备5
1.2.4病原菌孢子悬液制备5
1.2.5病原菌定殖实验5
1.2.6香蕉抗性基因的研究5
1.3数据统计与分析7
2 结果与分析7
2.1土壤微生物区系分析7
2.2不同土壤微生物群落与植物互作后对病原菌定值影响 7
2.3不同土壤微生物群落对香蕉抗性基因影响8
3讨论 9
致谢10
参考文献11
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
附录A 论文发表13
附录B 专利申请情况13
抑病型土壤中的微生物群落诱导香蕉植物抗病基因表达特性研究
引言
引言：香蕉是世界热带、亚热带地区的重要经济作物。近年来，随着香蕉的种植规模日益扩大，各类香蕉病虫害日益严重，严重威胁了香蕉产业的发展，其中香蕉枯萎病对香蕉产业的威胁最为严重[1]。自20世纪90年代初，东南亚地区发现4号小种侵染“卡文迪许”（香蕉品种）引起的香蕉枯萎病以来[23]，中国、澳洲、马来西亚、印度尼西亚、约旦、菲律宾、莫桑比克等国家均发现此病。香蕉枯萎病已严重威胁世界“卡文迪许”品种香蕉的生产[45]。
香蕉在中国的亚热带地区广泛栽培食用。虽然我国香蕉栽培面积从上个世纪70年代的0.46万公顷增长到了21世纪10年代的29.6万公顷，但是自从上世纪90年代之后，我国香蕉的栽培面积呈现明显的递减增长，特别是2008年以后，香蕉原产地珠江三角洲地区，因枯萎病发严重而导致香蕉园荒废的情况越来越多[6]。根据不完全统计，在海南、广东等主要香蕉栽培区，香蕉枯萎病的影响面积已经多达18 万公顷[7]，香蕉产区发病的香蕉园病株率为10%～40%, 严重的达90%以上[8]，2013 年海南的香蕉栽培面积相对2010年已减少接近50%[9]。
我国香蕉主产区90%以上的栽培品种为“卡文迪许”[10]。因香蕉种植利润高且稳定，我国大部分蕉园实行单一连作模式，导致土壤微生物区系失衡。据报道，2007年，珠江三角洲香蕉产区新蕉园，香蕉枯萎病的发病率16% 左右，老蕉园的发病率在90%以上[11]。由于农民对于香蕉枯萎病了解较少，其对香蕉枯萎病的防控不当，导致此病害迅速蔓延[6]，已严重威胁我国香蕉产业发展。
已有研究表明香蕉枯萎病病原菌有4个生理小种，不同生理小种的致病性差异较大[5]。樊小林等人的研究，表明施用碱性肥料能防控香蕉枯萎病，其机理主要是提高土壤中的PH值以抑制病原菌的生长，但其研究并未表明此种方法能从根本上长久地抑制香蕉枯萎病病原菌的生长[10]。
通过前期调查得知，海南香蕉主产区有连作多年而土传枯萎病发病率较低的蕉园，其土壤为香蕉抑病型土壤[12]。但是，现有研究并未能够搞清抑制香蕉土传枯萎病土壤的根际微生物区系的特征，以及这些微生物群落如何诱导香蕉应对病原菌入侵，现阶段，国内外主要研究热点主要集中在单个拮抗菌对植物的诱导抗性研究，Ryu等研究发现B. subtilis GB03和B.amyloquefaciens IN937a分泌的挥发性有机物，能够诱导拟南芥幼苗抵御软腐病原菌Erwinia carotovora sub sp. Carotovora[13]；枯草芽孢杆菌GB03能够诱导植物抗病体系防治黄瓜花叶病毒[14]；蜡状芽孢杆菌AR156能激发拟南芥中的水杨酸循环和茉莉酸/乙酸循环诱导PR基因表达来抵御丁香假单胞菌的侵袭[15]。
但是在生态系统中，微生物群落是一个整体，加上香蕉枯萎病是否发生，除受致病菌生理小种和香蕉植株本身的抗性影响外，还受环境条件诸如土壤温度、湿度、土壤中病原菌数量等因素的制约[16]。单个拮抗菌在整个复杂的土壤环境里发挥的效果有待考证。而研究整个的微生物群落对植物抗病性的影响意义会更大。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 供试作物
香蕉苗：巴西香牙蕉（Musa AAA Cavendish cv. Brazil），由海南省万钟实业有限公司组培厂提供。
1．1．2 供试土壤
水培实验所用抑病和导病土壤来自海南天地人生态农业股份有限公司香蕉连作地块，抑病土壤基本理化性质为：pH6.45，总氮1.63 g/kg，总碳16.54 g/kg，铵态氮（NH4+N）1.07 mg/kg，硝态氮（NO3N）1.51 mg/kg，速效磷204 mg/kg，速效钾582 mg/kg。导病土壤基本理化性质：pH为5.44，总氮1.46 g/kg，总碳14.90 g/kg，铵态氮（NH4+N）1.19 mg/kg，硝态氮（NO3N）2.26 mg/kg，1.51速效磷102 mg/kg，速效钾341mg/kg。
1．1．3 供试菌株
本实验所用菌株是含潮霉素抗性基因的香蕉枯萎病病原菌，以下简称RFOC，由本实验室师兄构建（未发表）。
1．1．4 供试培养基和试剂
PDA培养基：去皮的马铃薯200g，切成12 cm小块，煮沸20 min后用纱布过滤，取滤出液，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容到1L，pH自然，115℃高压蒸汽灭菌30min。
马丁氏培养基（即孟加拉红培养基）：蛋白胨5g、葡萄糖10g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁(MgSO47H2O) 0.5g、琼脂20g、1/3000孟加拉红溶液100 mL，去离子水1L，121℃灭菌20 min。
植物RNA提取试剂盒 Aidlab EASY spin Plus Plant RNA；反转录试剂盒Vazyme HiScript II Q RT SuperMix for qPCR；荧光定量PCR试剂盒 TaKaRa SYBR Premix Ex Taq
1．1．5 仪器
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