pahs污染对植物根表成膜细菌群落结构的影响
摘要：一些根表细菌生物膜具有促进植物生长，提高植物抗逆性以及降解根际有机污染物等生态功能。明确多环芳烃(PAHs)污染条件下根表成膜细菌的群落结构，有助于从植物根表分离筛选出具有PAHs降解功能的成膜细菌，规避植物PAHs污染风险。本文从长期受PAHs污染的场地采集了距污染源不同距离的土壤和植物（车前草(Plantago depressa Willd)和狗尾巴草(Setaria viridis (L.) Beauv)）样品，全面分析了供试样品中PAHs的含量，并利用PCR-DGGE(Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)技术探究了不同PAHs污染强度下根表成膜细菌的群落结构。结果表明，在土壤和植物样品中共检出7种PAHs，车前草和狗尾巴草体内PAHs的种类和浓度各不相同，但其PAHs含量均远大于土壤中PAHs的含量。PAHs污染条件下，车前草根表细菌的主要类群为变形杆菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)，狗尾巴草根表的细菌类群主要为变形杆菌门(Proteobacteria)，放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)。车前草和狗尾巴草根表成膜细菌的群落结构具有一定的差异性，且其多样性随着PAHs污染强度的增加而逐渐降低，同时其种类及优势菌群也发生较大改变，但一些优势类群如变形杆菌门(Proteobacteria)在不同PAHs污染强度下皆存在且占有重要比例，推测这些类群中的细菌可以利用PAHs为碳源生长或是具备PAHs降解功能。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 2
引言 2
1材料与方法 3
1.1实验材料 3
1.2实验方法 3
1.2.1土壤和植物样品中PAHs的测定 3
1.2.2根表细菌生物膜的分离和成膜细菌总DNA的提取 3
1.2.3土壤和根表成膜细菌16S rRNA基因V3区的PCR扩增 3
1.2.4
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
细菌16S rRNA基因V3区的DGGE分析 4
1.2.5特异条带克隆与序列分析 4
2结果与分析 4
2.1污染土壤与植物样品中PAHs的含量 4
2.1.1土壤中PAHs种类及含量 4
2.1.2植物体内PAHs种类及含量 5
2.2土壤和根表成膜细菌群落结构的PCRDGGE分析 7
2.3特异性条带克隆与序列分析 9
3讨论 13
4结论 14
致谢 15
参考文献： 16
PAHs污染对植物根表成膜细菌群落结构的影响
环境工程学生 邢佳佳
引言
我国土壤有机污染严重，污染物可以被植物吸收，通过食物链富集，进而威胁动物和人体健康，如何在污染土壤中生产出绿色健康的农产品已经成为研究的热点问题之一[14,5]。根表是植物根系与土壤的界面，是植物吸收有机污染物的重要窗口[68]。有机污染物从环境介质通过根表吸附、根系吸收进入植物根部，进而在植物体内积累[68,9]。多环芳烃(PAHs)是土壤环境中普遍存在的一类持久性有机污染物，具有难以降解，易在土壤中积累且毒性较强等特性[1011]。王戎等[12]研究了玉米根部对菲和芴的吸收过程，结果表明玉米幼苗根部对菲和芴的吸收量相似，大部分以强吸着态存在于根表，且根表吸着量普遍高于植物根内吸收量。同时，有研究结果表明，PAHs到达根表后，几乎不向植物内部迁移[13,14]。
细菌生物膜是附着在载体表面或不同介质界面的高度组织化、系统化的微生物膜性聚合物，是细菌在自然环境中普遍存在的一种生存方式[15]。研究表明，多数根际细菌可在植物根表形成细菌生物膜[16]。一些根际细菌在植物根表形成的细菌生物膜具有促进植物生长[17]，增强植物对根际有机污染物毒性效应的抵抗能力等作用[18]。Sarand等[19]从欧洲赤松根表生物膜中分离出1株Pseudomonas fluorescens，该菌能够有效地降解甲基苯甲酸酯和二甲苯。Villacieros等[20]将菌株Burkholderia sp. LB400中的多氯联苯(PCBs)降解基因bph克隆到可在多种植物根表定殖的菌株Pseudomonas fluorescens F113体内，使其能够在植物根表定殖形成细菌生物膜，从而有效地降解根际环境中的PCBs。由此推测，利用根表细菌生物膜对根际有机污染物的隔离和降解作用有望降低植物体内有机污染物的含量。因此，能否利用根表细菌生物膜降低植物对PAHs的吸收和积累，进而规避植物PAHs污染风险？
目前，关于根表细菌成膜作用对植物吸收积累PAHs的影响鲜有报道。而研究PAHs对植物根表成膜细菌群落结构的影响，有助于从植物根表分离筛选出具有PAHs降解功能的成膜细菌，并利用其在植物根表形成的细菌生物膜减低植物对PAHs的吸收积累，从而规避植物PAHs污染风险。基于此，本研究从PAHs污染场地的不同区域(重污染A即排污口、中污染Z即距排污口15~20 m、轻污染Q即距排污口30~35 m)采集污染土壤和植物样品，利用PCRDGGE技术分析了不同PAHs污染强度对植物根表成膜细菌群落结构多样性的影响，进而为从植物根表分离筛选出具有PAHs降解功能的成膜细菌提供理论基础，并为利用根表成膜细菌调控植物体内PAHs的吸收积累提供理论依据。
1材料与方法
1.1实验材料
供试土壤和植物：采自南京某石化芳烃厂距排污口不同距离的土壤(重污染A即排污口、中污染区Z即距排污口15~20 m和轻污染区Q即距排污口30~35 m)以及长势较好的两种常见植物车前草(Plantago depressa Willd)和狗尾巴草(Setaria viridis (L.) Beauv)，将所采集土壤和植物样品小心地放入封口袋中，迅速带回实验室，于4℃保存备用。
1.2 试验方法
1.2.1 土壤和植物样品中PAHs的测定
土壤和植物样品中PAHs的提取和测定参照文献进行[21]，具体步骤如下：
(1)土壤样品中PAHs测定方法：称取3 g冷冻干燥、过筛(20目)后的土样于25 mL玻璃离心管中，加入10 mL二氯甲烷提取液，超声萃取1 h后于4000 r min1离心20 min；移取3 mL上清液过2 g硅胶柱（层析柱类型为无标口无活塞有砂芯玻璃层析柱，内径为16 mm，长度为450mm），用11 mL 1: 1(V/V)的二氯甲烷与正己烷洗脱；后经旋转蒸发仪40℃蒸干，用甲醇定容至2 mL，过0.22 μm微孔滤膜，HPLC测定。
(2)植物样品中PAHs测定方法：称取一定量冷冻干燥后的植物样品，充分粉碎后放于25 mL的玻璃离心管中。向样品中加入30 mL 1: 1的二氯甲烷和正己烷溶液超声萃取，分3次进行，每次加入10 mL混合液、超声萃取30 min；收集萃取液过无水硫酸钠和硅胶柱，用1: 1的二氯甲烷和正己烷溶液洗脱；洗脱液经旋转蒸发仪40℃蒸干后用甲醇定容到2 mL，过0.22 μm微孔滤膜，HPLC测定。
(3)HPLC测定方法：色谱柱为5 μm，4.6×150 mm烷基C18反相柱(GL Sciences Inc.，日本)，流动相为色谱纯乙腈，流速1 mL min1，柱温40℃，进样量20 μL，检测波长245 nm。采用乙腈水梯度洗脱法：0~27.00 min：乙腈65%，水35%；27.00~45.00 min：乙腈100%；45.00~51.00 min：乙腈100%；51.00~56.00 min：乙腈65%，水35%；56.00~60.00 min：乙腈65%，水35%。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 2
引言 2
1材料与方法 3
1.1实验材料 3
1.2实验方法 3
1.2.1土壤和植物样品中PAHs的测定 3
1.2.2根表细菌生物膜的分离和成膜细菌总DNA的提取 3
1.2.3土壤和根表成膜细菌16S rRNA基因V3区的PCR扩增 3
1.2.4
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
细菌16S rRNA基因V3区的DGGE分析 4
1.2.5特异条带克隆与序列分析 4
2结果与分析 4
2.1污染土壤与植物样品中PAHs的含量 4
2.1.1土壤中PAHs种类及含量 4
2.1.2植物体内PAHs种类及含量 5
2.2土壤和根表成膜细菌群落结构的PCRDGGE分析 7
2.3特异性条带克隆与序列分析 9
3讨论 13
4结论 14
致谢 15
参考文献： 16
PAHs污染对植物根表成膜细菌群落结构的影响
环境工程学生 邢佳佳
引言
我国土壤有机污染严重，污染物可以被植物吸收，通过食物链富集，进而威胁动物和人体健康，如何在污染土壤中生产出绿色健康的农产品已经成为研究的热点问题之一[14,5]。根表是植物根系与土壤的界面，是植物吸收有机污染物的重要窗口[68]。有机污染物从环境介质通过根表吸附、根系吸收进入植物根部，进而在植物体内积累[68,9]。多环芳烃(PAHs)是土壤环境中普遍存在的一类持久性有机污染物，具有难以降解，易在土壤中积累且毒性较强等特性[1011]。王戎等[12]研究了玉米根部对菲和芴的吸收过程，结果表明玉米幼苗根部对菲和芴的吸收量相似，大部分以强吸着态存在于根表，且根表吸着量普遍高于植物根内吸收量。同时，有研究结果表明，PAHs到达根表后，几乎不向植物内部迁移[13,14]。
细菌生物膜是附着在载体表面或不同介质界面的高度组织化、系统化的微生物膜性聚合物，是细菌在自然环境中普遍存在的一种生存方式[15]。研究表明，多数根际细菌可在植物根表形成细菌生物膜[16]。一些根际细菌在植物根表形成的细菌生物膜具有促进植物生长[17]，增强植物对根际有机污染物毒性效应的抵抗能力等作用[18]。Sarand等[19]从欧洲赤松根表生物膜中分离出1株Pseudomonas fluorescens，该菌能够有效地降解甲基苯甲酸酯和二甲苯。Villacieros等[20]将菌株Burkholderia sp. LB400中的多氯联苯(PCBs)降解基因bph克隆到可在多种植物根表定殖的菌株Pseudomonas fluorescens F113体内，使其能够在植物根表定殖形成细菌生物膜，从而有效地降解根际环境中的PCBs。由此推测，利用根表细菌生物膜对根际有机污染物的隔离和降解作用有望降低植物体内有机污染物的含量。因此，能否利用根表细菌生物膜降低植物对PAHs的吸收和积累，进而规避植物PAHs污染风险？
目前，关于根表细菌成膜作用对植物吸收积累PAHs的影响鲜有报道。而研究PAHs对植物根表成膜细菌群落结构的影响，有助于从植物根表分离筛选出具有PAHs降解功能的成膜细菌，并利用其在植物根表形成的细菌生物膜减低植物对PAHs的吸收积累，从而规避植物PAHs污染风险。基于此，本研究从PAHs污染场地的不同区域(重污染A即排污口、中污染Z即距排污口15~20 m、轻污染Q即距排污口30~35 m)采集污染土壤和植物样品，利用PCRDGGE技术分析了不同PAHs污染强度对植物根表成膜细菌群落结构多样性的影响，进而为从植物根表分离筛选出具有PAHs降解功能的成膜细菌提供理论基础，并为利用根表成膜细菌调控植物体内PAHs的吸收积累提供理论依据。
1材料与方法
1.1实验材料
供试土壤和植物：采自南京某石化芳烃厂距排污口不同距离的土壤(重污染A即排污口、中污染区Z即距排污口15~20 m和轻污染区Q即距排污口30~35 m)以及长势较好的两种常见植物车前草(Plantago depressa Willd)和狗尾巴草(Setaria viridis (L.) Beauv)，将所采集土壤和植物样品小心地放入封口袋中，迅速带回实验室，于4℃保存备用。
1.2 试验方法
1.2.1 土壤和植物样品中PAHs的测定
土壤和植物样品中PAHs的提取和测定参照文献进行[21]，具体步骤如下：
(1)土壤样品中PAHs测定方法：称取3 g冷冻干燥、过筛(20目)后的土样于25 mL玻璃离心管中，加入10 mL二氯甲烷提取液，超声萃取1 h后于4000 r min1离心20 min；移取3 mL上清液过2 g硅胶柱（层析柱类型为无标口无活塞有砂芯玻璃层析柱，内径为16 mm，长度为450mm），用11 mL 1: 1(V/V)的二氯甲烷与正己烷洗脱；后经旋转蒸发仪40℃蒸干，用甲醇定容至2 mL，过0.22 μm微孔滤膜，HPLC测定。
(2)植物样品中PAHs测定方法：称取一定量冷冻干燥后的植物样品，充分粉碎后放于25 mL的玻璃离心管中。向样品中加入30 mL 1: 1的二氯甲烷和正己烷溶液超声萃取，分3次进行，每次加入10 mL混合液、超声萃取30 min；收集萃取液过无水硫酸钠和硅胶柱，用1: 1的二氯甲烷和正己烷溶液洗脱；洗脱液经旋转蒸发仪40℃蒸干后用甲醇定容到2 mL，过0.22 μm微孔滤膜，HPLC测定。
(3)HPLC测定方法：色谱柱为5 μm，4.6×150 mm烷基C18反相柱(GL Sciences Inc.，日本)，流动相为色谱纯乙腈，流速1 mL min1，柱温40℃，进样量20 μL，检测波长245 nm。采用乙腈水梯度洗脱法：0~27.00 min：乙腈65%，水35%；27.00~45.00 min：乙腈100%；45.00~51.00 min：乙腈100%；51.00~56.00 min：乙腈65%，水35%；56.00~60.00 min：乙腈65%，水35%。
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