硫酸还原菌参与水稻土壤中砷甲基化过程(附件)
砷是一种有毒的类金属元素且广泛地分布于自然环境中。近些年来，由于人为因素导致砷被大量释放到环境中，从而造成环境污染及对人体健康造成潜在的威胁。环境中存在的砷形态众多，其毒性取决于其存在形态，且各形态之间会发生转化，转化过程主要包括砷的氧化还原，砷甲基化，砷去甲基化过程。环境中砷的形态转化主要由微生物所介导。根据已有的报道，硫酸盐还原菌（SRB）参与汞的甲基化过程,同时在淹水水稻土壤中三价砷甲基转移酶基因（arsM）广泛分布于SRB 体内，本课题主要从水稻土壤中富集及分离具有三价砷（As(III)）甲基化能力的SRB，并通过添加专性抑制剂来验证SRB参与水稻土壤中As(III)得甲基化过程，为今后研究水稻土壤中微生物参与砷的生物地球化学循环提供理论依据。关键字砷；砷甲基化；硫酸盐还原菌SULFATE REDUCING BACTERIA MEDIATING ARSENIC METHYLATION IN PADDY SOILStudent majoring in Environmental Science Yang SHEN Tutor Fangjie ZHAOABSTRACT: Arsenic is the most prevalent toxic element and widely disturbed in the environment. Due to anthropic activities, Arsenic is dramatically released into the environment, causing health problems throughout the world. Various arsenic speciation has been detected and its toxicity was largely determined by its speciation and the speciation can be changed by the biological processes including arsenic reducing, oxidation, methylation and demethylation. Also, these processes were driven by microbes. *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
Previous studies illuminated that SRB was the dominate driver of mercury methylation, and Arsenite S-adenosylmethyltransferase (arsM) gene is abundant in paddy soils and widely disturbed in the SRB. we obtained the enrichment culture of SRB and isolate a strain of SRB which can convert As(III) to methyl-arsenic from paddy soils. Addition of Mo and MFP (specific inhibitors of SRB) can significantly suppress the As(III) methylation. The study illuminates that SRB play a major part in As(III) methylation in paddy soils and improve our understanding of As biogeochemical cycle in paddy soils.KEYWORDS: arsenic; arsenic methylation; SRB1 背景1.1砷的污染和危害1.1.1环境中砷的分布和来源 砷是一种在自然界广泛存在的有毒元素，原子序数为33，位于元素周期表的第ⅤA族。地壳中砷的含量为2-5mg/L,排列第二十位，在人类活动前很长时期，砷已对自然界平衡有影响，通过地壳，土壤，沉积物，水，空气和生物体而无处不在的分布。[1]环境中的砷主要有两个来源，一个是自然来源，另一个是人为来源。自然来源主要是地热火山喷发导致砷的释放，以及海生沉积物和岩石中伴生的砷释放，自然来源释放的砷决定了环境中砷的背景值，不仅如此，全球范围内的砷循环的主要驱动力是自然来源，使砷广泛分布于水和土壤等自然环境中，这也是在一些人类活动干涉较小的地区，环境中依然有较高浓度砷的原因。人为来源主要是指人类为了生存发展经济对自然资源的过度开采，如采矿，冶炼，施用含砷的农用化学品等，导致大量的砷进入环境，使当地的水和土壤受到污染。其中，人为来源是现今砷含量超标的主要原因。1.1.2砷污染的现状 目前，砷污染已成为一个全球性的环境污染问题，在全球许多国家与地区包括孟加拉国、印度、越南、澳大利亚、日本、美国及我国等都有关于水体和土壤砷污染的报道。[2]仅孟加拉国就有超过5700万人口因地下水砷超标而患有癌症的风险。我国砷污染形势的情势也不容乐观，尤其是湖南，云南，广西，广州的砷具有高度使用率的地区。据报道，我国目前受镉，砷，铅等重金属污染的耕地面积估计近20*107hm2[3]，不少人因摄入砷浓度过高的饮用水，导致地方性砷中毒。在正常情况下，人体会每天都会通过饮食摄入一定量的砷，通过人体消化系统和排泄系统，一部分的砷会排出人体，只要摄入量和排出量保持动态平衡，人体就不会处于中毒状态。但如果砷的摄入量远远超过了排出量，人体的机能 就会被干扰，情况严重则会中毒。除了地下水受砷污染较严重之外，水稻土神污染问题也日趋严重。1.1.3砷的形态与毒性 在自然界中，砷主要有四种价态- III价，0价，+III价和+ V价，+ V和+III最为常见，砷的形态主要分为无机砷和有机砷两种，无机砷主要为亚砷酸盐(As(III))、砷酸盐(As(V))、胂化氢(AsH3)及硫醇类的无机砷等。有机砷的种类较多包括单甲基砷酸盐(MAs(V))、二甲基砷酸盐(DMAs(V)),三价甲基砷氧化物(TMAs(V)O)、挥发性的甲基胂及硫醇类的甲基砷类物质等。[4 ]常见的含砷类物质如图1图1.常见的砷化合物结构式Figure1.common arsenic compound’s structural formulaArsenate:无机五价砷; Arsenite:无机三价砷; Monomethylarsonic acid:单甲基砷酸; Dimethylarsinic acid:二甲基砷酸; Trimrthylarsine oxide:三甲基砷氧化物; Tetramethylarsonium cation:三甲基砷酸盐; Arsenocholine:砷胆碱; Arsenobetaine:砷甜菜碱; Arsenosugar:砷糖。砷的毒性与其形态有关，一般情况下，无机砷的毒性大于有机砷，无机As(III)的毒性远高于As (V)，常见的不同形态的砷毒性排列顺序为DMAs(III)、MAs(III)＞As(III)＞As (V)＞DMAs(V)、MAs(V)＞TMAs(V)O[5]。1.1.4砷污染的危害 砷对植物，微生物以及人体都存在一定的毒性。砷通过干扰植物细胞的代谢来影响植物的生长，As(III)和As(V)的干扰方式不同，As(III)主要通过与植物细胞内巯基化合物结合扰乱植物的正常代谢过程，而As(V)则是通过与磷酸盐竞争细胞膜的转运体，取代磷来参与磷酸化反应，形成含砷的酯，且该酯的稳定性低于磷脂，随后该物质将会被水解[6],由此来影响植物对磷的吸收。砷对微生物也具有极强的毒性，过高环境浓度的砷会对微生物产生毒性，而砷的浓度越高，毒性则越强，使微生物群的数量减少，多样性降低，但同时也会筛选出具有较高砷耐性的特异菌株，使其生长为优势种，最终改变微生物的群落结构。砷通过食物链进入人体，干扰人体的正常神经，呼吸，生殖等系统，导致的疾病主要有糖尿病，涠洲血管病等。砷同时具有强烈的致癌性，长期的砷暴露例如职业暴露等可能会引起皮肤癌，肺癌，膀胱癌，肝癌和前列腺癌等多种癌症。[7]随着工业化进程的加快，含汞和砷废物的产生量不断增加，对环境，生物体的生存和人体身心健康造成直接或潜在的危害。建立健全相应的法制法规，以制度控制企业对有害废物排放，依法监管企业生产的全过程，使生产领域生态化。[8]综上，由于砷对植物，微生物以及人体都有严重的危害，砷污染已成为全球性的环境问题，而水稻土壤砷污染的范围较广，与人类的生活场所接近，且由于水稻环境为砷提供了较适合的还原条件，使砷的生物有效性较高及微生物参与其形态转化较多，所以砷在水稻土中的迁移转化研究十分重要。1.2常用的砷及砷的形态检测方法常用的砷及砷的形态检测方法大致有三类分光光度法，光谱法和电感耦合等离子体质谱技术（ICP-MS）其中分光光度法灵敏度低，操作繁琐，只能分析比较简单的砷化物，不适合用于砷的痕量分析[9]；荧光光谱法是测定砷的经典方法，具有灵敏度高的优点，是一种优良的痕量分析技术，但该法在操作上还是较为繁琐费时[10]；到目前为止，比较成熟且常用的方法为电感偶尔等离子体质谱技术（ICP-MS），该方法灵敏度高，抗干扰能力强，但其成本较高。1.3环境中微生物砷的转化环境中常见的砷的微生物转化过程主要包括三个部分As(III)的氧化，As(V)的还原，As的甲基化。1.3.1 As(III)的氧化 砷的氧化作用主要是将毒性较高的三价砷转化为毒性较低的五价砷，As(III)在有氧条件不稳定，容易被O2所氧化，反应速度较慢，但是在微生物的参与下，氧化速度被提高，这是微生物为了应对高毒性的As(III)所进化出来的一种解毒机制，当环境中的砷浓度很高时，它可以帮微生物更好的适应环境，减缓砷对自身的毒性，已发现的参与砷氧化的细菌主要有两类一类是化能异养型，这类细菌不仅可以起到解毒的作用，而且可以将As(III)作为电子供体，以及将CO2作为主要的碳源进行生长，如菌株NT-26和3As等。另一类是化能有机异养型，仅仅As(III)的氧化作为解毒机制，如NCIB8657，5A和ULPAs1等[11], As(III)的氧化机制是由As(III)氧化酶(AioAB)调控的，它的结构由大小两个亚基构成，其中一个以 [3Fe-4S]和钼碟呤为核心的大亚基，另一个是以[2Fe-2S]为中心的小亚基，成熟蛋白是由大小两个亚基组成的约100kD的异形二聚体。也有成熟的As(III)氧化酶是异形四聚体，如NT-26；以及异形六聚体，如NT-14。大小亚基都具有特定的保守区，如小亚基N端的双精氨酸信号肽识别区和[2Fe-2S]结合区(Cys-X-His-X15-Cys-X2-His)，大亚基的[3FEe4S]结合区(Cys-X2-Cys-X3-Cys-X70-Ser)和As(III)结合残基(His-X7-Glu，Arg-X3-His)。[12]电子传递途径为As(III)→钼碟呤→[2Fe-4S]→[2Fe-2S]→细胞色素C蛋白。1.3.2 As(V)的还原 As(V)的还原是指As(V)还原酶将进入微生物细胞的As(V)还原成As(III)。环境中存在许多可以还原As(V)的物质，如硫化物，二价铁和可溶性的有机酸等，但是在自然环境下，非生物的还原速率较低而且对pH的变化非常敏感，因此，微生物介导是砷还原的主要方式，微生物还原As(V)主要有两种方式一种是砷的异化还原，该过程是指微生物利用As(V)还原作为电子受体并供给自身能量的过程，催化微生物体内砷异化还原的酶是呼吸性As(V)还原酶ArrAB，该酶与As(III)氧化酶(AioAB)在结构上有许多的相似之处，它们均由一对亚基组成，含铁硫蛋白，TAT信号肽，大亚基上均有钼碟呤等。另一种砷的还原机制为细胞质还原，即砷的解毒型还原，它是砷微生物解毒的主要途径。指将好氧微生物将细胞质中的As(V)转化为As(III)的过程，形成的As(III)通过外排通道排出体外[13]，或者与巯基化合物结合[14]，降低生物活性。它与异化还原的差别在于细胞质还原不能从还原的过程中获得能量供微生物生长。目前，已有许多具有该功能的细菌被发现，比如大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，嗜盐古菌和枯草芽孢杆菌等。根据报道，砷的细胞质还原过程是由As(V)还原酶所催化的，目前为止一共有三种不同类型的酶第一种为大肠杆菌质粒R773上的ArsC，其内部的活性半胱氨酸位点可以利用谷胱甘肽和谷氧还蛋白作为电子供体。第二种代表类型是金黄色葡萄球菌质粒p1258上的ArsC，结构愈硫氧还蛋白还原酶接近，电子供体为硫氧还蛋白。第三种典型代表为酿酒酵母中的Acr2蛋白，主要存在于真菌之中，电子供体和R773一样同为谷胱甘肽和谷氧还蛋白。1.3.3微生物体内As的甲基化 砷的甲基化过程主要指无机As转化为非挥发性的甲基砷和挥发性甲基胂，非挥发性甲基砷包括MAs(V)，DMAs(V)，TMAs(V)O，挥发性甲基胂主要包括MAs(III)H2，DMAs(III)H，TMAs(III)。生物体内的砷的甲基化过程主要是在砷甲基转移酶(ArsM)的催化下进行，原核微生物中的ArsM主要分为两类一类是UbiE/Coq5 家族依赖S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的C型甲基转移酶，另一类是与MmtA相似的S和O型甲基转移酶。[15]砷甲基化的途径主要包括三种分别为1、Challenger途径该途径是一个由酶催化的连续的氧化甲基化及还原的过程，具体途径如下图2所示图2 .Challenger提出的砷甲基化途径示意图[16]Figure2. The sketch map of arsenic methylation presented by Challenger 该途径主要为As(V) → As(III) → MAs(V) → MAs(III) → DMAs(V) → DMAs(III) →TMAs(V)O→TMAs(III)，其中MAs(V)、DMAs(V)和TMAs(V)O是甲基化的终产物。2、Hayakawa途径2005年Hayakawa提出了第二条砷的甲基化途径Hayakawa认为谷胱甘肽络合物As(GS)3和MMA (GS)2 是作为甲基化的底物。在该途径中主要是以三价的砷为底物进行反应，并且产物主要砷三价砷，最后络合物MMAs(GS)2和DMAs (GS)分解为不稳定的MMAs (III)和DMAs(III)，它们遇空气后被迅速氧化为MMAs(V)和DMAs(V) [17]。3、2014年Naranmandura等提出了第三条砷的甲基化途径（如下图3，他们认为As(III)会和蛋白（hAS3MT）形成复合物，经过还原甲基化形成MAs(III)和DMAs(III)，且由于三价的砷化合物不稳定存在，所以三价态的砷化合物被氧化形成MAs(V)和DMAs(V)。图3.Naranmandura提出的砷甲基化途径示意图[18]Figure3. The sketch map of arsenic methylation presented by Naranmandura根据前文所描述的砷的形态与毒性之间的关系，可以发现当无机砷转变为三价甲基砷后其毒性增加，于是就有人质疑MAs(III)是不是砷的解毒机制，其实三价的甲基砷稳定性较差，当其释放到环境中后会被迅速的氧化成五价的甲基砷，而五价的甲基砷毒性低于As(III)，且甲基化的最终产物是气态的三甲基胂（(CH3)3As），三甲基胂的产生能使原始生境中的As排放到大气中从而达到解毒的目的，所以砷甲基化的结果相对于微生物而言为解毒过程。微生物体内As(III)甲基化是由As(III)甲基转移酶(ArsM)所催化的，As(III)不同程度甲基化的中间产物都由arsM基因所控制。1.4硫酸还原菌与重金属甲基化1.4.1硫酸还原菌概述 硫酸还原菌（Sulfate-Reducing Bacteria）是一类厌氧微生物，广泛分布于河道，土壤以及地下水道等缺氧环境。研究表明在无氧条件下，硫酸还原菌可以利用硫酸盐为电子受体，将正六价的硫还原为负二价，从而与氢离子相结合，产生硫化氢。 世界上第一株SRB由Bei jerinck在1895年发现，之后便有更多的SRB被发现，根据不完全的统计，已知有60个属220种SRB[19]，主要有脱硫丝菌属（Desulfonema），脱硫弧菌属（Desulfovibrio），脱硫球菌属（Desulfococcus），脱硫八叠球菌属（Desulfosarcina），脱硫肠菌属（Desulfotomaculum），脱磺单胞菌属（Desulfuromonas）和脱硫单胞菌属（Desulfomomas）等。[20]1.4.2硫酸还原菌与重金属之间的作用关系 前文已述硫酸还原菌可以将硫酸盐还原成硫化氢，并且可以和水中的重金属离子形成难溶于水的硫化物沉淀，如FeS等，同时，当S2-生成的同时，体系中的pH升高，更容易生成金属氢氧化物，而金属氢氧化物的溶解度普遍较低，所以往往以沉淀的形式析出，从而降低游离金属离子在溶液中的浓度，减少重金属离子对环境生物的影响。虽然过高浓度的重金属会对SRB造成毒害，但如果在硫酸还原菌的耐受范围之内，重金属离子则可以被硫酸还原菌所固定，吸附于细胞，从而降低生物活性。同时SRB会参与一些金属元素的形态转化过程，目前研究最多的是SRB参与Hg的甲基化过程。研究表明，汞的甲基化主要发生在厌氧环境中，硫酸还原菌被认为是该环境下汞甲基化最主要的驱动者。[21]本实验以此作为依据，将验证SRB参与砷的甲基化过程。2 材料与方法 2.1材料2.1.1供试土壤 实验室采集了湖南省郴州市砷污染水稻土壤（耕层0-20cm），采集运回风干处理，过2mm筛，过筛后的土壤置于阴暗处保存，并分析土壤部分理化性质。理化性质如下表1 郴州水稻土壤部分理化性质Location of soil sample (abbreviation)Total As(mg kg-1)SOM(g kg-1)Soil texturepHSO42-(mg kg-1)AvailableSi (mg/kg)Chenzhou paddy soil (CZ)8630.8Clay6.7431.765.52.1.2 SRB培养基 培养基成份为3.34gNaCl，0.8gMgCl2·6H2O，0.6gKCl， 0.3gCaCl2·2H2O，0.54g NH4Cl，0.4g KH2PO4，2g Yeast Extract，0.6g半胱氨酸盐酸盐，2mL刃天青。 利用NaOH调节pH至7.5, 加入600μL微量元素后置于电磁炉上煮沸，时间大约30min，培养基颜色逐渐从初始的深蓝色变成粉色，当其中的氧全部被去除后，培养基呈现无色。将血清瓶中的空气用氮气去除完全后，利用分液器将40mL培养基分装至100mL血清瓶中，利用硅胶塞及铝盖密封后灭菌（121oC, 20mins）。最后，向灭菌后的培养基中加入100μL维生素复合液，800μL乙酸钠（1mmol/L），800μL硫酸钠（1mmol/L），80μL As(III) （500μmol/L），其中，维生素作为微生物生长所必需的营养成分，乙酸钠提供碳源及电子供体，硫酸钠提供电子受体。2.2方法2.2.1富集培养水稻土壤中SRB SRB富集液在厌氧手套箱中制备，厌氧手套箱是至今为止国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一，其密封并充有惰性混合气体系保证了低氧环境。它采用钯催化剂，将密封箱内的氧气与厌氧混合气体（N2+CO2+H2）中的H2催化生成水，从而实现箱内的低氧状态。在配制土壤富集液时，须先将置物仓抽放气3次，使仓内的O2浓度降至最低，随后将样品送入箱内向灭菌的血清瓶中加入土壤样品。最后将血清瓶培养基置于30℃生化培养箱培养1周。2.2.2 SRB分离筛选 SRB分离采用厌氧滚管技术，首先配置SRB固体培养基，将装有无菌无氧琼脂5mL培养基的试管放置于水浴中加热熔化，待培养基温度降至50℃左右，加入生长所需因子。同时将菌液稀释至10-5，10-6，10-7，分别取 100μL菌液加入上述琼脂培养基中，在冰水中平放，迅速滚动，使试管壁上生成一层薄薄的培养基，将试管置于30℃生化培养箱培养，定期观察是否出现单菌落。挑菌 在手套箱中，用已灭菌的枪头挑取厌氧管中不同形态的单菌落于事先准备好的厌氧培养基中，置于30℃生化培养箱培养。反复重复以上步骤数次，直到纯化出SRB单菌。2.2.3验证SRB富集液及SRB单菌As(III)甲基化能力 2.2.3.1硫离子测定 实验室采用N, N—二甲基对苯二胺光度法分析培养物中硫化物含量，在含高浓度铁离子的酸性溶液中，S2-与N, N—二甲基对苯二胺作用生成亚甲蓝，颜色的深度与水中的S2-浓度成正比，使用紫外分光光度计测定浓度，波长为665nm。反应体系为400μL乙酸锌—乙酸钠溶液，200μL N, N—二甲基对苯二胺溶液，20μL硫酸铁铵溶液，100μL样品，超纯水补足2mL体系。 2.2.3.2 OD600测定SRB的OD600（optical density）同样使用紫外分光光度计来测定，值得注意的是当OD600值为0.2至0.8时线性关系较好，可以直接使用分光光度计的示数，但当OD值超过1.0时，线性关系较差，理应先将样品稀释，在进行测定，最终数据要乘以稀释倍数，本实验将通过测定不同时间点的硫酸还原菌OD值，以此来反映细菌生长情况。2.2.3.3砷形态测定 利用HPLC-ICP-MS分析砷形态。HPLC(series 300, PerkinElmer)条件为流动相8.5mM NH4H2PO4, 8.5mM NH4NO3 ，pH 6.0。分离柱采用阴离子柱 （Hamilton PRP-X100; 250 mm by 4.6 mm）,流速为1.0。分离后的不同砷形态进入到ICP-MS(NexION 300D, PerkinElmer)进行检测。检测同时加入元素锗作为内标来实时监测仪器稳定性。2.2.3.4 dsr基因拷贝数测定 本实验通过绝对定量PCR分析（Real-time PCR）来测定土壤中dsr基因的拷贝数，引物为DSRF+ (ACSCACTGGAAGCACGGCGG)和DSRR (GTGGMRCCGTGCAKRTTGG). . 首先制作标准曲线，利用普通PCR扩增出土壤中dsr基因，并将所得的PCR产物切胶纯化回收，进行TA克隆并获得阳性克隆子。将阳性克隆子培养并提取质粒。测定所提取的质粒浓度，连续逐级稀释10倍的质粒DNA作为模板来制作绝对定量所需要的标准曲线。其次，利用荧光定量PCR仪来定量SRB富集液中dsr基因丰度。2.2.4专性抑制剂对砷甲基转移酶（ArsM）活性的影响2.2.4.1提取并纯化 ArsM 为了证明Mo是否会对ArsM活性产生影响, 首先我们设计并合成引物（引物序列如下表2）分别扩增出菌株Bacillus sp.CX-1，Desulfosporosinus meridiei DSM 13257，Desulfotomaculum gibsoniae DSM 7213体内的arsM基因，扩增体系及程序为 模板1μL，引物F1μL，引物R1μL，H2O32.5μL，GxL0.5μL，dNTP mixture4μL，GxL Buffer10μL。扩增程序为预变性98℃（2min），变性98℃（10s），退火59℃（15s），延伸72℃（1min），30个循环，72℃（10min），12℃（5min）。表2 扩增arsM基因所用引物BlarsM-FGGGAATTCCATATGATGAGCGAATCAAATTTTCAGACATBlarsM-RCCGCTCGAGTTTTTTACCGCAAATCAGATAATAACCDmarsM-FGGGAATTCCATATGATGATAGACACTAAAGAAGAGATTAGAGACTTDmarsM-RCCGCTCGAGTTTTCTTGCCTCGATAATATAAGAAGCDgarsM-FGGGAATTCCATATGATGAAAGACAAAGAAGATATCAGGGAATDgarsM-RCCGCTCGAGTTCCTTTACCGCCTCAATTATATAAGA跑胶验证PCR产物并切胶回收。由于扩增的同时在基因的两端引入了NdeI和XhoI两个酶切位点，所以利用这两个限制性内切酶双酶切PCR产物，酶切后的产物经试剂盒回收后克隆进入到用相同两个酶切的线性化表达载体pET29a(+)，并最终构成三个表达载体pET29a-BlarsM, pET29a-DgarsM, pET29a-DmarsM。将三个表达载体分别转化进入大肠杆菌菌株BL21，转化方法如下。最终获得的三个阳性克隆子即为构建好的重组菌株。大肠杆菌感受态细胞的转化首先将酶连产物10μL加到100μL Ecoli.sp BL21感受态细胞中，用枪头吸打至混匀，置于冰上30min，接着将样品放入42℃水浴热激45s，并迅速静置于冰上孵育2min，随后加入500μLLB培养基中混匀，37℃摇床，200rpm，复苏1h，将复苏后的菌液离心浓缩后均匀涂于含有卡那霉素的LB平板。ArsM蛋白功能验证将成功转入arsM基因的大肠杆菌接种LB培养基中，置于37℃摇床，200rpm培养。待菌株生长至对数期后将菌液按1%比例转移到100ml新鲜的LB培养基中并置于37℃培养。待OD600=0.6，加入0.3mM的IPTG，在16℃下诱导16h，随后将菌液12000rpm离心收集菌体，用Buffer A（20mM Na3PO4, pH 7.4）洗涤菌体2次，最终用25ml Buffer A重悬菌体，并将菌体超声破碎，12000rpm离心40min去除破碎后的细胞碎片等。将上清液过0.45μm滤膜得到总蛋白，将总蛋白过Ni柱并利用特定浓度的咪唑浓度洗脱不同的ArsM（4oC），通过SDS-PAGE跑胶验证不同ArsM。利用Nanodrap2000 测定所纯化的ArsM的浓度。 利用纯化的ArsM来验证抑制剂（Mo及MFP）对其活性的影响。反应体系为10μM As(III), 8mM GSH, 1mM SAM, 1.5μM ArsM, 20mM Mo/ 20mM MFP，缓冲液补足2mL体系。反应24h后利用30% H2O2终止反应，并利用HPLC-ICP MS分析体系中砷形态。3结果与讨论 3.1 SRB主要参与水稻土壤中砷的甲基化过程图1.Mo对郴州水稻土壤孔隙水中DMAs(V)动态变化及dsr转录子丰度的影响Figure5. The influence of Mo to DMAs(V) and dsr transcripts 图1为郴州水稻土壤在淹水过程中，土壤孔隙水中DMAs(V)的动态变化及土壤中dsr转录子的丰度。图1结果显示在对照土壤中，孔隙水中DMAs(V)含量呈现先产生后消失的趋势。在水稻淹水前两周内，DMAs(V)逐渐产生，并在第二周达到峰值。随后DMAs(V)逐渐消失，DMAs(V)消失可能由于土壤中存在其他的厌氧微生物能将DMAs(V)转化为其他形态的砷。然而添加Mo后在整个土壤培养周期内均未检测到DMAs(V)，说明Mo抑制了土壤中DMAs(V)的产生。同时添加Mo显著地降低了水稻土壤中dsr转录子的丰度，而dsr转录子能有效的反应水稻土壤中活性SRB的丰度。所以，当水稻土壤中SRB被抑制的前提下，砷的甲基化同步受到抑制，即SRB主要参与了郴州水稻土壤中砷的甲基化过程。3.2抑制剂对SRB富集液中砷甲基化的影响 图2.抑制剂对SRB富集液中砷甲基化的影响Figure2. The influence of inhibitors to arsenic methylation 通过利用SRB专性培养基富集土壤中的SRB，我们得到了SRB富集液且该富集液具有As(III)甲基化能力。为了进一步验证在该富集液中SRB是As(III)甲基化的主要驱动者，我们向该富集液中加入了SRB专性抑制剂。结果显示在未加抑制剂的SRB富集液产生了约1.2μM的甲基砷，且主要形态为MAs(V)和DMAs(V)。添加Mo显著地降低了富集液中甲基砷的含量，而添加MFP后对甲基砷含量影响不显著。图3.抑制剂对SRB富集液中可溶性硫化物含量以及dsr基因丰度的影响Figure3. The influence of inhibitors to S2- and dsr gene 图3为抑制剂对SRB富集液中可溶性硫化物含量及dsr基因丰度的影响。结果显示，富集液中S2-的生成是因为SRB将SO42-异化还原为S2-，而添加Mo后富集液中S2-的含量明显地降低，由此可说明硫酸盐还原过程被抑制，此外，dsr基因的拷贝数与对照相比也明显降低，表明Mo抑制了SRB的生长。而MFP的对SRB的作用则不太明显，无论是对S2-的生成还是dsrAB基因的拷贝，抑制作用均弱于Mo。该结果也很好的解释了添加MFP后对富集液中砷甲基化能力影响不大。3.3 SRB菌株Clostridium sp. CZ-1具有砷甲基化能力 为了排除土壤中其他微生物的干扰，本试验通过厌氧滚管技术分离出单菌SRB，并且对其功能进行了验证。图4.抑制剂对单菌CZ-1的影响Figure4. The influence of inhibitors to single bacteria CZ-1从上述培养基中我们分离纯化出一株具有硫酸盐还原能力且同时具有As(III)甲基化能力的菌株Clostridium sp. CZ-1。图4结果显示，菌株CZ-1具有将As(III)转化为MAs(V)和DMAs(V)的能力，同时添加Mo及MFP均能有效地抑制甲基砷的产生。且添加Mo及MFP抑制了菌株CZ-1的生长从而抑制其硫酸盐还原能力。该结果从正面验证了Mo及MFP通过抑制SRB菌株的生长来抑制砷的甲基化作用。3.4 Mo对ArsM活性的影响根据上文的数据可知，Mo和MFP可以通过抑制SRB的生长来抑制As的甲基化，但是在As甲基化过程中，ArsM蛋白起着至关重要的调控作用， Mo是否对ArsM活性也会产生影响有待研究。因此本试验通过体外酶活实验来验证抑制剂对ArsM活性的影响。图5.抑制剂ArsM酶蛋白的影响Figure5. The influence of inhibitors to ArsM 本实验体外纯化了三种ArsM蛋白，并针对这三种蛋白做了体外酶活实验。结果显示反应24h后，BlArsM及DmArsM几乎能将As(III)全部转化为DMAs(V), DgArsM能将As(III)全部甲基化为DMAs(V)及TMAs(V)O。添加Mo后，反应体系中甲基砷产量稍微降低，而MFP对甲基砷得产量几乎没有影响。该实验结果说明，Mo及MFP对ArsM活性影响较小。4实验结论本实验通过土壤培养实验，SRB富集抑制剂实验及体外酶活实验等验证了SRB是水稻土壤中砷甲基化的主要驱动者。该结论为我们研究水稻土壤中砷的生物地球化学循环提供理论依据。致谢参考文献[1] 魏大成. 环境中砷的来源. 西安交通大学远程医学中心. 2003[2] Mohammed Abdul, K. S.; Jayasinghe, S. S.; Chandana, E. P.; et al. Arsenic and human health effects: A review [J]. Environmental Toxicology & Pharmacology, 2015, 40(3): 828[3] 陈怀满，土壤-植物系统中的重金属污染[M]. 北京科学出版社，1996.43.1035-1041.[4] Sharma, V. K.; Sohn, M. 2009. Aquatic arsenic: Toxicity, speciation, transformations, and remediation. Environment International, 35(4), 743-759.[5] Qin, J.; Rosen, B. P.; Zhang, Y.; Wang, G. J.; Franke, S.; Rensing, C. 2006b. Arsenic detoxification and evolution of trimethylarsine gas by a microbial arsenite S-adenosylmethionine methyltransferase. 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目录
摘要1
关键字1
Abstract1
Keywords1
引言1
1.背景1
1.1砷的污染和危害1
1.1.1环境中砷的分布和来源1
1.1.2砷污染的现状2
1.1.3砷的形态与毒性2
1.1.4砷污染的危害2
1.2常用的砷及砷的形态检测方法3
1.3环境中微生物砷的转化3
1.3.1 As(III)的氧化3
1.3.2 As(V)的还原3
1.3.3微生物体内 As的甲基化4
1.4硫酸还原菌与重金属甲基化5
1.4.1硫酸还原菌概述5
1.4.2硫酸还原菌与重金属之间的作用关系5
2 材料与方法5
2.1材料5
2.1.1供试土壤5
2.1.2SRB培养基6
2.2方法6
2.2.1富集水稻土壤中SRB6
2.2.2SRB分离筛选6
2.2.3验证SRB富集液及SRB单菌As(III)甲基化能力6
2.2.3.1硫离子测定6
2.2.3.2 OD600测定6
2.2.3.3 砷形态测定6
2.2.3.4 dsr基因拷贝数测定6
2.2.4专性抑制剂对砷甲基转移酶（ArsM）活性的影响6
2.2.4.1提取并纯化ArsM7
3.结果与讨论7
3.1SRB主要参与水稻土壤砷甲基化过程8
3.2抑制剂对SRB富集液中砷甲基化影响8
3.3 SRB菌株Clostridium sp. CZ1具有砷甲基化能力9
3.4Mo对ArsM活性的影响10
4.实验结论10
致谢11
参考文献11
硫酸还原菌参与水稻土壤中砷甲基化过程
引言
Previous studies illuminated that SRB was the dominate driver of mercury methylation, and Arsenite S-adenosylmethyltransferase (arsM) gene is abundant in paddy soils and widely disturbed in the SRB. we obtained the enrichment culture of SRB and isolate a strain of SRB which can convert As(III) to methyl-arsenic from paddy soils. Addition of Mo and MFP (specific inhibitors of SRB) can significantly suppress the As(III) methylation. The study illuminates that SRB play a major part in As(III) methylation in paddy soils and improve our understanding of As biogeochemical cycle in paddy soils.KEYWORDS: arsenic; arsenic methylation; SRB1 背景1.1砷的污染和危害1.1.1环境中砷的分布和来源 砷是一种在自然界广泛存在的有毒元素，原子序数为33，位于元素周期表的第ⅤA族。地壳中砷的含量为2-5mg/L,排列第二十位，在人类活动前很长时期，砷已对自然界平衡有影响，通过地壳，土壤，沉积物，水，空气和生物体而无处不在的分布。[1]环境中的砷主要有两个来源，一个是自然来源，另一个是人为来源。自然来源主要是地热火山喷发导致砷的释放，以及海生沉积物和岩石中伴生的砷释放，自然来源释放的砷决定了环境中砷的背景值，不仅如此，全球范围内的砷循环的主要驱动力是自然来源，使砷广泛分布于水和土壤等自然环境中，这也是在一些人类活动干涉较小的地区，环境中依然有较高浓度砷的原因。人为来源主要是指人类为了生存发展经济对自然资源的过度开采，如采矿，冶炼，施用含砷的农用化学品等，导致大量的砷进入环境，使当地的水和土壤受到污染。其中，人为来源是现今砷含量超标的主要原因。1.1.2砷污染的现状 目前，砷污染已成为一个全球性的环境污染问题，在全球许多国家与地区包括孟加拉国、印度、越南、澳大利亚、日本、美国及我国等都有关于水体和土壤砷污染的报道。[2]仅孟加拉国就有超过5700万人口因地下水砷超标而患有癌症的风险。我国砷污染形势的情势也不容乐观，尤其是湖南，云南，广西，广州的砷具有高度使用率的地区。据报道，我国目前受镉，砷，铅等重金属污染的耕地面积估计近20*107hm2[3]，不少人因摄入砷浓度过高的饮用水，导致地方性砷中毒。在正常情况下，人体会每天都会通过饮食摄入一定量的砷，通过人体消化系统和排泄系统，一部分的砷会排出人体，只要摄入量和排出量保持动态平衡，人体就不会处于中毒状态。但如果砷的摄入量远远超过了排出量，人体的机能 就会被干扰，情况严重则会中毒。除了地下水受砷污染较严重之外，水稻土神污染问题也日趋严重。1.1.3砷的形态与毒性 在自然界中，砷主要有四种价态- III价，0价，+III价和+ V价，+ V和+III最为常见，砷的形态主要分为无机砷和有机砷两种，无机砷主要为亚砷酸盐(As(III))、砷酸盐(As(V))、胂化氢(AsH3)及硫醇类的无机砷等。有机砷的种类较多包括单甲基砷酸盐(MAs(V))、二甲基砷酸盐(DMAs(V)),三价甲基砷氧化物(TMAs(V)O)、挥发性的甲基胂及硫醇类的甲基砷类物质等。[4 ]常见的含砷类物质如图1图1.常见的砷化合物结构式Figure1.common arsenic compound’s structural formulaArsenate:无机五价砷; Arsenite:无机三价砷; Monomethylarsonic acid:单甲基砷酸; Dimethylarsinic acid:二甲基砷酸; Trimrthylarsine oxide:三甲基砷氧化物; Tetramethylarsonium cation:三甲基砷酸盐; Arsenocholine:砷胆碱; Arsenobetaine:砷甜菜碱; Arsenosugar:砷糖。砷的毒性与其形态有关，一般情况下，无机砷的毒性大于有机砷，无机As(III)的毒性远高于As (V)，常见的不同形态的砷毒性排列顺序为DMAs(III)、MAs(III)＞As(III)＞As (V)＞DMAs(V)、MAs(V)＞TMAs(V)O[5]。1.1.4砷污染的危害 砷对植物，微生物以及人体都存在一定的毒性。砷通过干扰植物细胞的代谢来影响植物的生长，As(III)和As(V)的干扰方式不同，As(III)主要通过与植物细胞内巯基化合物结合扰乱植物的正常代谢过程，而As(V)则是通过与磷酸盐竞争细胞膜的转运体，取代磷来参与磷酸化反应，形成含砷的酯，且该酯的稳定性低于磷脂，随后该物质将会被水解[6],由此来影响植物对磷的吸收。砷对微生物也具有极强的毒性，过高环境浓度的砷会对微生物产生毒性，而砷的浓度越高，毒性则越强，使微生物群的数量减少，多样性降低，但同时也会筛选出具有较高砷耐性的特异菌株，使其生长为优势种，最终改变微生物的群落结构。砷通过食物链进入人体，干扰人体的正常神经，呼吸，生殖等系统，导致的疾病主要有糖尿病，涠洲血管病等。砷同时具有强烈的致癌性，长期的砷暴露例如职业暴露等可能会引起皮肤癌，肺癌，膀胱癌，肝癌和前列腺癌等多种癌症。[7]随着工业化进程的加快，含汞和砷废物的产生量不断增加，对环境，生物体的生存和人体身心健康造成直接或潜在的危害。建立健全相应的法制法规，以制度控制企业对有害废物排放，依法监管企业生产的全过程，使生产领域生态化。[8]综上，由于砷对植物，微生物以及人体都有严重的危害，砷污染已成为全球性的环境问题，而水稻土壤砷污染的范围较广，与人类的生活场所接近，且由于水稻环境为砷提供了较适合的还原条件，使砷的生物有效性较高及微生物参与其形态转化较多，所以砷在水稻土中的迁移转化研究十分重要。1.2常用的砷及砷的形态检测方法常用的砷及砷的形态检测方法大致有三类分光光度法，光谱法和电感耦合等离子体质谱技术（ICP-MS）其中分光光度法灵敏度低，操作繁琐，只能分析比较简单的砷化物，不适合用于砷的痕量分析[9]；荧光光谱法是测定砷的经典方法，具有灵敏度高的优点，是一种优良的痕量分析技术，但该法在操作上还是较为繁琐费时[10]；到目前为止，比较成熟且常用的方法为电感偶尔等离子体质谱技术（ICP-MS），该方法灵敏度高，抗干扰能力强，但其成本较高。1.3环境中微生物砷的转化环境中常见的砷的微生物转化过程主要包括三个部分As(III)的氧化，As(V)的还原，As的甲基化。1.3.1 As(III)的氧化 砷的氧化作用主要是将毒性较高的三价砷转化为毒性较低的五价砷，As(III)在有氧条件不稳定，容易被O2所氧化，反应速度较慢，但是在微生物的参与下，氧化速度被提高，这是微生物为了应对高毒性的As(III)所进化出来的一种解毒机制，当环境中的砷浓度很高时，它可以帮微生物更好的适应环境，减缓砷对自身的毒性，已发现的参与砷氧化的细菌主要有两类一类是化能异养型，这类细菌不仅可以起到解毒的作用，而且可以将As(III)作为电子供体，以及将CO2作为主要的碳源进行生长，如菌株NT-26和3As等。另一类是化能有机异养型，仅仅As(III)的氧化作为解毒机制，如NCIB8657，5A和ULPAs1等[11], As(III)的氧化机制是由As(III)氧化酶(AioAB)调控的，它的结构由大小两个亚基构成，其中一个以 [3Fe-4S]和钼碟呤为核心的大亚基，另一个是以[2Fe-2S]为中心的小亚基，成熟蛋白是由大小两个亚基组成的约100kD的异形二聚体。也有成熟的As(III)氧化酶是异形四聚体，如NT-26；以及异形六聚体，如NT-14。大小亚基都具有特定的保守区，如小亚基N端的双精氨酸信号肽识别区和[2Fe-2S]结合区(Cys-X-His-X15-Cys-X2-His)，大亚基的[3FEe4S]结合区(Cys-X2-Cys-X3-Cys-X70-Ser)和As(III)结合残基(His-X7-Glu，Arg-X3-His)。[12]电子传递途径为As(III)→钼碟呤→[2Fe-4S]→[2Fe-2S]→细胞色素C蛋白。1.3.2 As(V)的还原 As(V)的还原是指As(V)还原酶将进入微生物细胞的As(V)还原成As(III)。环境中存在许多可以还原As(V)的物质，如硫化物，二价铁和可溶性的有机酸等，但是在自然环境下，非生物的还原速率较低而且对pH的变化非常敏感，因此，微生物介导是砷还原的主要方式，微生物还原As(V)主要有两种方式一种是砷的异化还原，该过程是指微生物利用As(V)还原作为电子受体并供给自身能量的过程，催化微生物体内砷异化还原的酶是呼吸性As(V)还原酶ArrAB，该酶与As(III)氧化酶(AioAB)在结构上有许多的相似之处，它们均由一对亚基组成，含铁硫蛋白，TAT信号肽，大亚基上均有钼碟呤等。另一种砷的还原机制为细胞质还原，即砷的解毒型还原，它是砷微生物解毒的主要途径。指将好氧微生物将细胞质中的As(V)转化为As(III)的过程，形成的As(III)通过外排通道排出体外[13]，或者与巯基化合物结合[14]，降低生物活性。它与异化还原的差别在于细胞质还原不能从还原的过程中获得能量供微生物生长。目前，已有许多具有该功能的细菌被发现，比如大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，嗜盐古菌和枯草芽孢杆菌等。根据报道，砷的细胞质还原过程是由As(V)还原酶所催化的，目前为止一共有三种不同类型的酶第一种为大肠杆菌质粒R773上的ArsC，其内部的活性半胱氨酸位点可以利用谷胱甘肽和谷氧还蛋白作为电子供体。第二种代表类型是金黄色葡萄球菌质粒p1258上的ArsC，结构愈硫氧还蛋白还原酶接近，电子供体为硫氧还蛋白。第三种典型代表为酿酒酵母中的Acr2蛋白，主要存在于真菌之中，电子供体和R773一样同为谷胱甘肽和谷氧还蛋白。1.3.3微生物体内As的甲基化 砷的甲基化过程主要指无机As转化为非挥发性的甲基砷和挥发性甲基胂，非挥发性甲基砷包括MAs(V)，DMAs(V)，TMAs(V)O，挥发性甲基胂主要包括MAs(III)H2，DMAs(III)H，TMAs(III)。生物体内的砷的甲基化过程主要是在砷甲基转移酶(ArsM)的催化下进行，原核微生物中的ArsM主要分为两类一类是UbiE/Coq5 家族依赖S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的C型甲基转移酶，另一类是与MmtA相似的S和O型甲基转移酶。[15]砷甲基化的途径主要包括三种分别为1、Challenger途径该途径是一个由酶催化的连续的氧化甲基化及还原的过程，具体途径如下图2所示图2 .Challenger提出的砷甲基化途径示意图[16]Figure2. The sketch map of arsenic methylation presented by Challenger 该途径主要为As(V) → As(III) → MAs(V) → MAs(III) → DMAs(V) → DMAs(III) →TMAs(V)O→TMAs(III)，其中MAs(V)、DMAs(V)和TMAs(V)O是甲基化的终产物。2、Hayakawa途径2005年Hayakawa提出了第二条砷的甲基化途径Hayakawa认为谷胱甘肽络合物As(GS)3和MMA (GS)2 是作为甲基化的底物。在该途径中主要是以三价的砷为底物进行反应，并且产物主要砷三价砷，最后络合物MMAs(GS)2和DMAs (GS)分解为不稳定的MMAs (III)和DMAs(III)，它们遇空气后被迅速氧化为MMAs(V)和DMAs(V) [17]。3、2014年Naranmandura等提出了第三条砷的甲基化途径（如下图3，他们认为As(III)会和蛋白（hAS3MT）形成复合物，经过还原甲基化形成MAs(III)和DMAs(III)，且由于三价的砷化合物不稳定存在，所以三价态的砷化合物被氧化形成MAs(V)和DMAs(V)。图3.Naranmandura提出的砷甲基化途径示意图[18]Figure3. The sketch map of arsenic methylation presented by Naranmandura根据前文所描述的砷的形态与毒性之间的关系，可以发现当无机砷转变为三价甲基砷后其毒性增加，于是就有人质疑MAs(III)是不是砷的解毒机制，其实三价的甲基砷稳定性较差，当其释放到环境中后会被迅速的氧化成五价的甲基砷，而五价的甲基砷毒性低于As(III)，且甲基化的最终产物是气态的三甲基胂（(CH3)3As），三甲基胂的产生能使原始生境中的As排放到大气中从而达到解毒的目的，所以砷甲基化的结果相对于微生物而言为解毒过程。微生物体内As(III)甲基化是由As(III)甲基转移酶(ArsM)所催化的，As(III)不同程度甲基化的中间产物都由arsM基因所控制。1.4硫酸还原菌与重金属甲基化1.4.1硫酸还原菌概述 硫酸还原菌（Sulfate-Reducing Bacteria）是一类厌氧微生物，广泛分布于河道，土壤以及地下水道等缺氧环境。研究表明在无氧条件下，硫酸还原菌可以利用硫酸盐为电子受体，将正六价的硫还原为负二价，从而与氢离子相结合，产生硫化氢。 世界上第一株SRB由Bei jerinck在1895年发现，之后便有更多的SRB被发现，根据不完全的统计，已知有60个属220种SRB[19]，主要有脱硫丝菌属（Desulfonema），脱硫弧菌属（Desulfovibrio），脱硫球菌属（Desulfococcus），脱硫八叠球菌属（Desulfosarcina），脱硫肠菌属（Desulfotomaculum），脱磺单胞菌属（Desulfuromonas）和脱硫单胞菌属（Desulfomomas）等。[20]1.4.2硫酸还原菌与重金属之间的作用关系 前文已述硫酸还原菌可以将硫酸盐还原成硫化氢，并且可以和水中的重金属离子形成难溶于水的硫化物沉淀，如FeS等，同时，当S2-生成的同时，体系中的pH升高，更容易生成金属氢氧化物，而金属氢氧化物的溶解度普遍较低，所以往往以沉淀的形式析出，从而降低游离金属离子在溶液中的浓度，减少重金属离子对环境生物的影响。虽然过高浓度的重金属会对SRB造成毒害，但如果在硫酸还原菌的耐受范围之内，重金属离子则可以被硫酸还原菌所固定，吸附于细胞，从而降低生物活性。同时SRB会参与一些金属元素的形态转化过程，目前研究最多的是SRB参与Hg的甲基化过程。研究表明，汞的甲基化主要发生在厌氧环境中，硫酸还原菌被认为是该环境下汞甲基化最主要的驱动者。[21]本实验以此作为依据，将验证SRB参与砷的甲基化过程。2 材料与方法 2.1材料2.1.1供试土壤 实验室采集了湖南省郴州市砷污染水稻土壤（耕层0-20cm），采集运回风干处理，过2mm筛，过筛后的土壤置于阴暗处保存，并分析土壤部分理化性质。理化性质如下表1 郴州水稻土壤部分理化性质Location of soil sample (abbreviation)Total As(mg kg-1)SOM(g kg-1)Soil texturepHSO42-(mg kg-1)AvailableSi (mg/kg)Chenzhou paddy soil (CZ)8630.8Clay6.7431.765.52.1.2 SRB培养基 培养基成份为3.34gNaCl，0.8gMgCl2·6H2O，0.6gKCl， 0.3gCaCl2·2H2O，0.54g NH4Cl，0.4g KH2PO4，2g Yeast Extract，0.6g半胱氨酸盐酸盐，2mL刃天青。 利用NaOH调节pH至7.5, 加入600μL微量元素后置于电磁炉上煮沸，时间大约30min，培养基颜色逐渐从初始的深蓝色变成粉色，当其中的氧全部被去除后，培养基呈现无色。将血清瓶中的空气用氮气去除完全后，利用分液器将40mL培养基分装至100mL血清瓶中，利用硅胶塞及铝盖密封后灭菌（121oC, 20mins）。最后，向灭菌后的培养基中加入100μL维生素复合液，800μL乙酸钠（1mmol/L），800μL硫酸钠（1mmol/L），80μL As(III) （500μmol/L），其中，维生素作为微生物生长所必需的营养成分，乙酸钠提供碳源及电子供体，硫酸钠提供电子受体。2.2方法2.2.1富集培养水稻土壤中SRB SRB富集液在厌氧手套箱中制备，厌氧手套箱是至今为止国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一，其密封并充有惰性混合气体系保证了低氧环境。它采用钯催化剂，将密封箱内的氧气与厌氧混合气体（N2+CO2+H2）中的H2催化生成水，从而实现箱内的低氧状态。在配制土壤富集液时，须先将置物仓抽放气3次，使仓内的O2浓度降至最低，随后将样品送入箱内向灭菌的血清瓶中加入土壤样品。最后将血清瓶培养基置于30℃生化培养箱培养1周。2.2.2 SRB分离筛选 SRB分离采用厌氧滚管技术，首先配置SRB固体培养基，将装有无菌无氧琼脂5mL培养基的试管放置于水浴中加热熔化，待培养基温度降至50℃左右，加入生长所需因子。同时将菌液稀释至10-5，10-6，10-7，分别取 100μL菌液加入上述琼脂培养基中，在冰水中平放，迅速滚动，使试管壁上生成一层薄薄的培养基，将试管置于30℃生化培养箱培养，定期观察是否出现单菌落。挑菌 在手套箱中，用已灭菌的枪头挑取厌氧管中不同形态的单菌落于事先准备好的厌氧培养基中，置于30℃生化培养箱培养。反复重复以上步骤数次，直到纯化出SRB单菌。2.2.3验证SRB富集液及SRB单菌As(III)甲基化能力 2.2.3.1硫离子测定 实验室采用N, N—二甲基对苯二胺光度法分析培养物中硫化物含量，在含高浓度铁离子的酸性溶液中，S2-与N, N—二甲基对苯二胺作用生成亚甲蓝，颜色的深度与水中的S2-浓度成正比，使用紫外分光光度计测定浓度，波长为665nm。反应体系为400μL乙酸锌—乙酸钠溶液，200μL N, N—二甲基对苯二胺溶液，20μL硫酸铁铵溶液，100μL样品，超纯水补足2mL体系。 2.2.3.2 OD600测定SRB的OD600（optical density）同样使用紫外分光光度计来测定，值得注意的是当OD600值为0.2至0.8时线性关系较好，可以直接使用分光光度计的示数，但当OD值超过1.0时，线性关系较差，理应先将样品稀释，在进行测定，最终数据要乘以稀释倍数，本实验将通过测定不同时间点的硫酸还原菌OD值，以此来反映细菌生长情况。2.2.3.3砷形态测定 利用HPLC-ICP-MS分析砷形态。HPLC(series 300, PerkinElmer)条件为流动相8.5mM NH4H2PO4, 8.5mM NH4NO3 ，pH 6.0。分离柱采用阴离子柱 （Hamilton PRP-X100; 250 mm by 4.6 mm）,流速为1.0。分离后的不同砷形态进入到ICP-MS(NexION 300D, PerkinElmer)进行检测。检测同时加入元素锗作为内标来实时监测仪器稳定性。2.2.3.4 dsr基因拷贝数测定 本实验通过绝对定量PCR分析（Real-time PCR）来测定土壤中dsr基因的拷贝数，引物为DSRF+ (ACSCACTGGAAGCACGGCGG)和DSRR (GTGGMRCCGTGCAKRTTGG). . 首先制作标准曲线，利用普通PCR扩增出土壤中dsr基因，并将所得的PCR产物切胶纯化回收，进行TA克隆并获得阳性克隆子。将阳性克隆子培养并提取质粒。测定所提取的质粒浓度，连续逐级稀释10倍的质粒DNA作为模板来制作绝对定量所需要的标准曲线。其次，利用荧光定量PCR仪来定量SRB富集液中dsr基因丰度。2.2.4专性抑制剂对砷甲基转移酶（ArsM）活性的影响2.2.4.1提取并纯化 ArsM 为了证明Mo是否会对ArsM活性产生影响, 首先我们设计并合成引物（引物序列如下表2）分别扩增出菌株Bacillus sp.CX-1，Desulfosporosinus meridiei DSM 13257，Desulfotomaculum gibsoniae DSM 7213体内的arsM基因，扩增体系及程序为 模板1μL，引物F1μL，引物R1μL，H2O32.5μL，GxL0.5μL，dNTP mixture4μL，GxL Buffer10μL。扩增程序为预变性98℃（2min），变性98℃（10s），退火59℃（15s），延伸72℃（1min），30个循环，72℃（10min），12℃（5min）。表2 扩增arsM基因所用引物BlarsM-FGGGAATTCCATATGATGAGCGAATCAAATTTTCAGACATBlarsM-RCCGCTCGAGTTTTTTACCGCAAATCAGATAATAACCDmarsM-FGGGAATTCCATATGATGATAGACACTAAAGAAGAGATTAGAGACTTDmarsM-RCCGCTCGAGTTTTCTTGCCTCGATAATATAAGAAGCDgarsM-FGGGAATTCCATATGATGAAAGACAAAGAAGATATCAGGGAATDgarsM-RCCGCTCGAGTTCCTTTACCGCCTCAATTATATAAGA跑胶验证PCR产物并切胶回收。由于扩增的同时在基因的两端引入了NdeI和XhoI两个酶切位点，所以利用这两个限制性内切酶双酶切PCR产物，酶切后的产物经试剂盒回收后克隆进入到用相同两个酶切的线性化表达载体pET29a(+)，并最终构成三个表达载体pET29a-BlarsM, pET29a-DgarsM, pET29a-DmarsM。将三个表达载体分别转化进入大肠杆菌菌株BL21，转化方法如下。最终获得的三个阳性克隆子即为构建好的重组菌株。大肠杆菌感受态细胞的转化首先将酶连产物10μL加到100μL Ecoli.sp BL21感受态细胞中，用枪头吸打至混匀，置于冰上30min，接着将样品放入42℃水浴热激45s，并迅速静置于冰上孵育2min，随后加入500μLLB培养基中混匀，37℃摇床，200rpm，复苏1h，将复苏后的菌液离心浓缩后均匀涂于含有卡那霉素的LB平板。ArsM蛋白功能验证将成功转入arsM基因的大肠杆菌接种LB培养基中，置于37℃摇床，200rpm培养。待菌株生长至对数期后将菌液按1%比例转移到100ml新鲜的LB培养基中并置于37℃培养。待OD600=0.6，加入0.3mM的IPTG，在16℃下诱导16h，随后将菌液12000rpm离心收集菌体，用Buffer A（20mM Na3PO4, pH 7.4）洗涤菌体2次，最终用25ml Buffer A重悬菌体，并将菌体超声破碎，12000rpm离心40min去除破碎后的细胞碎片等。将上清液过0.45μm滤膜得到总蛋白，将总蛋白过Ni柱并利用特定浓度的咪唑浓度洗脱不同的ArsM（4oC），通过SDS-PAGE跑胶验证不同ArsM。利用Nanodrap2000 测定所纯化的ArsM的浓度。 利用纯化的ArsM来验证抑制剂（Mo及MFP）对其活性的影响。反应体系为10μM As(III), 8mM GSH, 1mM SAM, 1.5μM ArsM, 20mM Mo/ 20mM MFP，缓冲液补足2mL体系。反应24h后利用30% H2O2终止反应，并利用HPLC-ICP MS分析体系中砷形态。3结果与讨论 3.1 SRB主要参与水稻土壤中砷的甲基化过程图1.Mo对郴州水稻土壤孔隙水中DMAs(V)动态变化及dsr转录子丰度的影响Figure5. The influence of Mo to DMAs(V) and dsr transcripts 图1为郴州水稻土壤在淹水过程中，土壤孔隙水中DMAs(V)的动态变化及土壤中dsr转录子的丰度。图1结果显示在对照土壤中，孔隙水中DMAs(V)含量呈现先产生后消失的趋势。在水稻淹水前两周内，DMAs(V)逐渐产生，并在第二周达到峰值。随后DMAs(V)逐渐消失，DMAs(V)消失可能由于土壤中存在其他的厌氧微生物能将DMAs(V)转化为其他形态的砷。然而添加Mo后在整个土壤培养周期内均未检测到DMAs(V)，说明Mo抑制了土壤中DMAs(V)的产生。同时添加Mo显著地降低了水稻土壤中dsr转录子的丰度，而dsr转录子能有效的反应水稻土壤中活性SRB的丰度。所以，当水稻土壤中SRB被抑制的前提下，砷的甲基化同步受到抑制，即SRB主要参与了郴州水稻土壤中砷的甲基化过程。3.2抑制剂对SRB富集液中砷甲基化的影响 图2.抑制剂对SRB富集液中砷甲基化的影响Figure2. The influence of inhibitors to arsenic methylation 通过利用SRB专性培养基富集土壤中的SRB，我们得到了SRB富集液且该富集液具有As(III)甲基化能力。为了进一步验证在该富集液中SRB是As(III)甲基化的主要驱动者，我们向该富集液中加入了SRB专性抑制剂。结果显示在未加抑制剂的SRB富集液产生了约1.2μM的甲基砷，且主要形态为MAs(V)和DMAs(V)。添加Mo显著地降低了富集液中甲基砷的含量，而添加MFP后对甲基砷含量影响不显著。图3.抑制剂对SRB富集液中可溶性硫化物含量以及dsr基因丰度的影响Figure3. The influence of inhibitors to S2- and dsr gene 图3为抑制剂对SRB富集液中可溶性硫化物含量及dsr基因丰度的影响。结果显示，富集液中S2-的生成是因为SRB将SO42-异化还原为S2-，而添加Mo后富集液中S2-的含量明显地降低，由此可说明硫酸盐还原过程被抑制，此外，dsr基因的拷贝数与对照相比也明显降低，表明Mo抑制了SRB的生长。而MFP的对SRB的作用则不太明显，无论是对S2-的生成还是dsrAB基因的拷贝，抑制作用均弱于Mo。该结果也很好的解释了添加MFP后对富集液中砷甲基化能力影响不大。3.3 SRB菌株Clostridium sp. CZ-1具有砷甲基化能力 为了排除土壤中其他微生物的干扰，本试验通过厌氧滚管技术分离出单菌SRB，并且对其功能进行了验证。图4.抑制剂对单菌CZ-1的影响Figure4. The influence of inhibitors to single bacteria CZ-1从上述培养基中我们分离纯化出一株具有硫酸盐还原能力且同时具有As(III)甲基化能力的菌株Clostridium sp. CZ-1。图4结果显示，菌株CZ-1具有将As(III)转化为MAs(V)和DMAs(V)的能力，同时添加Mo及MFP均能有效地抑制甲基砷的产生。且添加Mo及MFP抑制了菌株CZ-1的生长从而抑制其硫酸盐还原能力。该结果从正面验证了Mo及MFP通过抑制SRB菌株的生长来抑制砷的甲基化作用。3.4 Mo对ArsM活性的影响根据上文的数据可知，Mo和MFP可以通过抑制SRB的生长来抑制As的甲基化，但是在As甲基化过程中，ArsM蛋白起着至关重要的调控作用， Mo是否对ArsM活性也会产生影响有待研究。因此本试验通过体外酶活实验来验证抑制剂对ArsM活性的影响。图5.抑制剂ArsM酶蛋白的影响Figure5. The influence of inhibitors to ArsM 本实验体外纯化了三种ArsM蛋白，并针对这三种蛋白做了体外酶活实验。结果显示反应24h后，BlArsM及DmArsM几乎能将As(III)全部转化为DMAs(V), DgArsM能将As(III)全部甲基化为DMAs(V)及TMAs(V)O。添加Mo后，反应体系中甲基砷产量稍微降低，而MFP对甲基砷得产量几乎没有影响。该实验结果说明，Mo及MFP对ArsM活性影响较小。4实验结论本实验通过土壤培养实验，SRB富集抑制剂实验及体外酶活实验等验证了SRB是水稻土壤中砷甲基化的主要驱动者。该结论为我们研究水稻土壤中砷的生物地球化学循环提供理论依据。致谢参考文献[1] 魏大成. 环境中砷的来源. 西安交通大学远程医学中心. 2003[2] Mohammed Abdul, K. S.; Jayasinghe, S. S.; Chandana, E. P.; et al. Arsenic and human health effects: A review [J]. Environmental Toxicology & Pharmacology, 2015, 40(3): 828[3] 陈怀满，土壤-植物系统中的重金属污染[M]. 北京科学出版社，1996.43.1035-1041.[4] Sharma, V. K.; Sohn, M. 2009. Aquatic arsenic: Toxicity, speciation, transformations, and remediation. Environment International, 35(4), 743-759.[5] Qin, J.; Rosen, B. P.; Zhang, Y.; Wang, G. J.; Franke, S.; Rensing, C. 2006b. Arsenic detoxification and evolution of trimethylarsine gas by a microbial arsenite S-adenosylmethionine methyltransferase. 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目录
摘要1
关键字1
Abstract1
Keywords1
引言1
1.背景1
1.1砷的污染和危害1
1.1.1环境中砷的分布和来源1
1.1.2砷污染的现状2
1.1.3砷的形态与毒性2
1.1.4砷污染的危害2
1.2常用的砷及砷的形态检测方法3
1.3环境中微生物砷的转化3
1.3.1 As(III)的氧化3
1.3.2 As(V)的还原3
1.3.3微生物体内 As的甲基化4
1.4硫酸还原菌与重金属甲基化5
1.4.1硫酸还原菌概述5
1.4.2硫酸还原菌与重金属之间的作用关系5
2 材料与方法5
2.1材料5
2.1.1供试土壤5
2.1.2SRB培养基6
2.2方法6
2.2.1富集水稻土壤中SRB6
2.2.2SRB分离筛选6
2.2.3验证SRB富集液及SRB单菌As(III)甲基化能力6
2.2.3.1硫离子测定6
2.2.3.2 OD600测定6
2.2.3.3 砷形态测定6
2.2.3.4 dsr基因拷贝数测定6
2.2.4专性抑制剂对砷甲基转移酶（ArsM）活性的影响6
2.2.4.1提取并纯化ArsM7
3.结果与讨论7
3.1SRB主要参与水稻土壤砷甲基化过程8
3.2抑制剂对SRB富集液中砷甲基化影响8
3.3 SRB菌株Clostridium sp. CZ1具有砷甲基化能力9
3.4Mo对ArsM活性的影响10
4.实验结论10
致谢11
参考文献11
硫酸还原菌参与水稻土壤中砷甲基化过程
引言
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