高效pgpr菌群的构建及其抑制青枯病的效果研究
摘要：实验目的为探索细菌的基因型多样性与群落生态功能之间存在的关系。通过室内试验，研究8株番茄青枯病病原菌拮抗菌的碳源利用特征，并设置1、2、4、8四个基因型丰度的细菌群落，利用微孔板系统来研究基因型丰富度与群落生产力和群落抗青枯病病原菌Ralstonia solanacearum入侵能力，并通过温室盆栽试验来验证微孔板系统的实验成果。结果表明，细菌的基因型多样性越高，群落生产力越高，群落抗青枯病病原菌入侵能力越高。物种的多样性能够强化细菌群落生态系统的功能。拮抗细菌的群落多样性越高，群落能抵御青枯病入侵的能力也就越强，同时也更稳定。多样性越高，群落占据的生态位可能越多，与青枯菌生态位重叠指数也较多，那么青枯菌的实际生态位可能就越少。多样性越高，群落产生的对青枯菌有抑制能力的代谢物质越多，那青枯菌获得的实际生态位可能就越少。温室盆栽实验也得到类似的结果，随着群落丰富度的增加，对青枯病的防控效率越高。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法5
1.1 供试材料 5
1.1.1 供试菌株5
1.1.2 供试培养基、营养液和主要试剂5
1.1.3 供试碳源和主要仪器5
1.1.4 供试土壤6
1.1.5 供试番茄6
1.2 假单胞菌菌株拮抗番茄青枯病病原菌Ralstonia solanacearum能力的测定6
1.2.1 青枯菌悬液的制备6
1.2.2 点接喷雾法测定拮抗菌的拮抗能力6
1.3 假单胞菌碳源利用特征试验6
1.3.1 假单胞菌碳源利用谱测定6
1.4 组合菌群落拮抗病原菌试验7
1.4.1 群落组合方案7
1.4.2 不同群落组合的生产力测定8
1.4.3 不同群落组合抵抗病原菌入侵能力的测定8
1.5 温室盆栽试验8
1.5.1 催芽、育苗和移苗8
1.5.2 假单胞菌与青枯菌菌悬液的准备8
1.5.3 试验处理8
1.5.4 发病率
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
统计及番茄植株生物量测定8
1.6 数据处理9
2 结果与分析9
2.1 假单胞菌菌株拮抗番茄青枯病病原菌Ralstonia solanacearum能力的测定结果9
2.1.1 平板对峙拮抗病原菌的效果9
2.2 假单胞菌对碳源的利用情况9
2.2.1 假单胞菌碳源利用谱9
2.3 组合菌群拮抗病原菌的结果11
2.3.1 不同基因型丰度群落组合的生产力11
2.3.2 不同基因型丰度群落抗病原菌入侵能力11
2.4 盆栽试验结果11
2.4.1 温室盆栽发病率与细菌基因型丰度的关系11
2.4.2 番茄植株干重与细菌基因型丰度的关系12
3 讨论12
致谢13
参考文献14
高效PGPR菌群的构建及其抑制青枯病的效果研究
引言
引言 番茄的栽培在全世界范围内都十分广泛。番茄的种植在我国十分普遍，每个地区均广泛种植，种植方式有大面积温室栽培、塑料大棚栽培及其它保护地设施栽培。这些年来，随着种植面积的扩大和种植年限的延长，单一的栽培品种、不尽合理的品种结构、不恰当的栽培模式以及管理技术，这些均导致番茄病害的发生越发普遍。其中，番茄青枯病是重要的土传病害之一，在中国南方区域番茄生产上最为流行[1,2]。
青枯病是由茄科劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum，以下简称青枯菌）引起的一种毁灭性土传细菌病害，广泛分布在热带、亚热带及温带等气候温润的地区[3]。人类进入二十一世纪以来，由于“温室效应”的影响，导致全球气候大幅变暖，茄科劳尔氏菌开始呈现出向高纬度冷凉地区蔓延的趋向，这些都威胁着作物产量的提高 [4]。青枯病的防治是一大世界难题，青枯菌分布广泛，寄主范围广，小种复杂，存活和传播能力强。单一的防治措施对于控制青枯病难有成效。对于植物青枯病的防治研究，国内外一直是以综合防治为主，常用防治番茄青枯病的策略包括使用化学农药、改善土壤质量、研发抗病品种、采取嫁接与轮作方式等，但效果均不稳定[1,5,6]。此外，过量施用化学农药带来的环境污染和食品安全问题，引起人们广泛关注和担忧。所以采用发展环境友好型的防病措施已刻不容缓，常见的措施有生物防治，通过减少农药的使用量，可抑制病害的发展，并实现恢复土壤健康以及保障食品安全的目标。
生物防治是指通过生物或其代谢产物来控制有害生物种群的发生、繁殖或是减轻其为害的一种防治方法[7]。生物防治不但可以显著抑制植物病害，同时对于生态环境的保护也有益处，因此生物防治不仅受到生产者的关注，也是当前研究的重点。生物防治植物土传病害是指利用有益微生物（如真菌、细菌和放线菌等）分泌拮抗物质来诱导植物抗病，并通过与病原菌竞争生态位和营养等方式来抑制或消灭植物病原菌的一种防治方法。由于生物防治对环境、生态和人类健康都很安全，从而受到了国内外生产者的青睐，并发挥重要的作用[8]。
利用拮抗微生物防治青枯病是目前研究的热点问题，并取得一定的效果。但总体而言，国内外生物防治番茄土传青枯病尚处在菌种资源收集阶段。目前报道的生防菌资源包括无（弱）致病力青枯菌[9]、芽孢杆菌属[1012]、假单胞菌属[7,13]、嗜麦芽寡养假单胞菌[14]、不动杆菌属和肠杆菌属[15]、寡雄腐霉[16]和链霉菌属[17,18]等，但由于田间防效不稳定，实际应用的较少。其中假单胞菌常用于生物防治植物病害和促进植物生长[19]。
PGPR是指生存在植物根圈范围中，对植物生长有促进或对病原菌有拮抗作用的有益细菌的统称。利用PGPR控制土传病害增加了土壤有益微生物类群，有利于恢复土壤生态平衡，实现农业可持续发展，是目前研究的热点。目前已有大量PGPR防治土传青枯病的报道[20,21]，然而在室内和温室生防效果好的PGPR，在田间应用时效果却不稳定[22]。其中一个重要原因是单一生防菌易受温度、土壤结构、pH、水分含量、根系分泌物、捕食者（原生动物）及土著微生物等的影响。研究表明施入土壤的PGPR的根际定殖能力不稳定，无法稳定抵御病原菌对根系的入侵是影响其应用效果的瓶颈问题[16]。导致这一现象的原因在于以往的研究工作重心在筛菌和应用,在机理方面主要针对某1株PGPR的生防机理做深入的研究[23,24]，没有把土壤中微生物之间及微生物群落之间的相互作用机理联系起来，缺乏对根际生态系统这一黑匣子的研究。
大部分关于PGPR与青枯菌根际竞争的机制的报道都忽略了PGPR菌群之间及与青枯菌交互作用的研究。生物多样性是生态系统功能的主要决定性因素，土壤生态系统是一个整体，其稳定性必然受到土壤微生物多样性的影响，生物多样性不仅促进土壤中物种间积极的相互作用，同时也加剧了群落内生物之间的竞争作用[25,26]。土壤微生物是土壤生态系统中不可或缺的组成部分，对于稳固整个土壤生态系统的能量流动和物质循环都发挥着关键作用，同时土壤微生物的多样性也影响着土壤生态系统的结构、功能和过程[27]。所以研究土壤微生物之间的相互作用和PGPR菌群多样性及其稳定抵御病原菌侵染的机制对防治作物土传病害具有重要意义。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法5
1.1 供试材料 5
1.1.1 供试菌株5
1.1.2 供试培养基、营养液和主要试剂5
1.1.3 供试碳源和主要仪器5
1.1.4 供试土壤6
1.1.5 供试番茄6
1.2 假单胞菌菌株拮抗番茄青枯病病原菌Ralstonia solanacearum能力的测定6
1.2.1 青枯菌悬液的制备6
1.2.2 点接喷雾法测定拮抗菌的拮抗能力6
1.3 假单胞菌碳源利用特征试验6
1.3.1 假单胞菌碳源利用谱测定6
1.4 组合菌群落拮抗病原菌试验7
1.4.1 群落组合方案7
1.4.2 不同群落组合的生产力测定8
1.4.3 不同群落组合抵抗病原菌入侵能力的测定8
1.5 温室盆栽试验8
1.5.1 催芽、育苗和移苗8
1.5.2 假单胞菌与青枯菌菌悬液的准备8
1.5.3 试验处理8
1.5.4 发病率
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
统计及番茄植株生物量测定8
1.6 数据处理9
2 结果与分析9
2.1 假单胞菌菌株拮抗番茄青枯病病原菌Ralstonia solanacearum能力的测定结果9
2.1.1 平板对峙拮抗病原菌的效果9
2.2 假单胞菌对碳源的利用情况9
2.2.1 假单胞菌碳源利用谱9
2.3 组合菌群拮抗病原菌的结果11
2.3.1 不同基因型丰度群落组合的生产力11
2.3.2 不同基因型丰度群落抗病原菌入侵能力11
2.4 盆栽试验结果11
2.4.1 温室盆栽发病率与细菌基因型丰度的关系11
2.4.2 番茄植株干重与细菌基因型丰度的关系12
3 讨论12
致谢13
参考文献14
高效PGPR菌群的构建及其抑制青枯病的效果研究
引言
引言 番茄的栽培在全世界范围内都十分广泛。番茄的种植在我国十分普遍，每个地区均广泛种植，种植方式有大面积温室栽培、塑料大棚栽培及其它保护地设施栽培。这些年来，随着种植面积的扩大和种植年限的延长，单一的栽培品种、不尽合理的品种结构、不恰当的栽培模式以及管理技术，这些均导致番茄病害的发生越发普遍。其中，番茄青枯病是重要的土传病害之一，在中国南方区域番茄生产上最为流行[1,2]。
青枯病是由茄科劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum，以下简称青枯菌）引起的一种毁灭性土传细菌病害，广泛分布在热带、亚热带及温带等气候温润的地区[3]。人类进入二十一世纪以来，由于“温室效应”的影响，导致全球气候大幅变暖，茄科劳尔氏菌开始呈现出向高纬度冷凉地区蔓延的趋向，这些都威胁着作物产量的提高 [4]。青枯病的防治是一大世界难题，青枯菌分布广泛，寄主范围广，小种复杂，存活和传播能力强。单一的防治措施对于控制青枯病难有成效。对于植物青枯病的防治研究，国内外一直是以综合防治为主，常用防治番茄青枯病的策略包括使用化学农药、改善土壤质量、研发抗病品种、采取嫁接与轮作方式等，但效果均不稳定[1,5,6]。此外，过量施用化学农药带来的环境污染和食品安全问题，引起人们广泛关注和担忧。所以采用发展环境友好型的防病措施已刻不容缓，常见的措施有生物防治，通过减少农药的使用量，可抑制病害的发展，并实现恢复土壤健康以及保障食品安全的目标。
生物防治是指通过生物或其代谢产物来控制有害生物种群的发生、繁殖或是减轻其为害的一种防治方法[7]。生物防治不但可以显著抑制植物病害，同时对于生态环境的保护也有益处，因此生物防治不仅受到生产者的关注，也是当前研究的重点。生物防治植物土传病害是指利用有益微生物（如真菌、细菌和放线菌等）分泌拮抗物质来诱导植物抗病，并通过与病原菌竞争生态位和营养等方式来抑制或消灭植物病原菌的一种防治方法。由于生物防治对环境、生态和人类健康都很安全，从而受到了国内外生产者的青睐，并发挥重要的作用[8]。
利用拮抗微生物防治青枯病是目前研究的热点问题，并取得一定的效果。但总体而言，国内外生物防治番茄土传青枯病尚处在菌种资源收集阶段。目前报道的生防菌资源包括无（弱）致病力青枯菌[9]、芽孢杆菌属[1012]、假单胞菌属[7,13]、嗜麦芽寡养假单胞菌[14]、不动杆菌属和肠杆菌属[15]、寡雄腐霉[16]和链霉菌属[17,18]等，但由于田间防效不稳定，实际应用的较少。其中假单胞菌常用于生物防治植物病害和促进植物生长[19]。
PGPR是指生存在植物根圈范围中，对植物生长有促进或对病原菌有拮抗作用的有益细菌的统称。利用PGPR控制土传病害增加了土壤有益微生物类群，有利于恢复土壤生态平衡，实现农业可持续发展，是目前研究的热点。目前已有大量PGPR防治土传青枯病的报道[20,21]，然而在室内和温室生防效果好的PGPR，在田间应用时效果却不稳定[22]。其中一个重要原因是单一生防菌易受温度、土壤结构、pH、水分含量、根系分泌物、捕食者（原生动物）及土著微生物等的影响。研究表明施入土壤的PGPR的根际定殖能力不稳定，无法稳定抵御病原菌对根系的入侵是影响其应用效果的瓶颈问题[16]。导致这一现象的原因在于以往的研究工作重心在筛菌和应用,在机理方面主要针对某1株PGPR的生防机理做深入的研究[23,24]，没有把土壤中微生物之间及微生物群落之间的相互作用机理联系起来，缺乏对根际生态系统这一黑匣子的研究。
大部分关于PGPR与青枯菌根际竞争的机制的报道都忽略了PGPR菌群之间及与青枯菌交互作用的研究。生物多样性是生态系统功能的主要决定性因素，土壤生态系统是一个整体，其稳定性必然受到土壤微生物多样性的影响，生物多样性不仅促进土壤中物种间积极的相互作用，同时也加剧了群落内生物之间的竞争作用[25,26]。土壤微生物是土壤生态系统中不可或缺的组成部分，对于稳固整个土壤生态系统的能量流动和物质循环都发挥着关键作用，同时土壤微生物的多样性也影响着土壤生态系统的结构、功能和过程[27]。所以研究土壤微生物之间的相互作用和PGPR菌群多样性及其稳定抵御病原菌侵染的机制对防治作物土传病害具有重要意义。
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