雌三醇的降解特性研究
摘要：随着工业化的进程，雌激素污染的影响日益严重，成为人类健康很大的潜在威胁因素，关系着人类的生存繁衍。本研究选择雌三醇为目标物，探索其在不同环境条件下的降解特性，以期为研究雌激素固定化并为后期在水体、粪便中处理雌激素提供支持。实验表明，菌株AIR-1为好氧生长，30℃、150r·min-1摇床培养7d，菌株对培养基中雌三醇的降解率高于99%。适宜菌株降解E3的环境条件为25~35℃，pH7~8，初始底物雌三醇浓度50 mg·L-1，菌种接种量5%。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
引言 3
1 材料与方法 4
1.1 实验材料 4
1.2 培养基 4
1.3 雌三醇降解实验 4
1.4 数据分析 5
2 结论与讨论 6
2.1 菌株ARI1对雌三醇降解能力测定 5
2.2 环境条件对菌株降解雌三醇的影响 6
3 结论 8
4 研究展望 8
致谢 8
参考文献 8
Novosphingobium sp.ARI1对雌三醇的降解特性研究
引言
引言
环境雌激素是指由于自然产生或者人类的生产和生活活动而释放到周围环境中，影响人体和动物体内的正常激素功能及内分泌系统的化学物质[1]。科学家们主要研究了不同环境中的污染物，包括污水处理厂[2]、人工湿地[3]、土壤[4]、河流[56]、地下水和含水层沉淀物[7]、海洋和海洋沉淀物[810]等，结果表明这些环境中都存在不同程度的雌激素污染。
环境雌激素属于类固醇物质，主要由人和动物体内卵巢细胞产生。雌激素根据其结构可分为游离态和结合态，游离态雌激素包括17α雌二醇（17αE2）、17β雌二醇（17βE2）、雌酮（E1）和雌三醇（E3），其中17β雌二醇的雌激素活性最强[11]。
环境雌激素大多为脂溶性，化学性质稳定，可通过食物链富集，进入机体后生物半衰期较长，难以生物降解，不易排出甚至不排
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
出。环境雌激素可干扰机体内分泌系统的功能，影响体内激素的合成、释放、转运、代谢及结合等过程，进而严重影响机体生殖生产，改变机体免疫功能，影响神经细胞的活动及神经系统的传导能力，导致神经系统发育延迟、智力损伤等[12]，对身体各部分机能造成不同程度影响。
本文选择雌三醇为目标物，探索其在不同环境条件下的降解特性，以期为研究雌激素固定化并为后期在水体、粪便中处理雌激素提供支持。
1 材料与方法
1.1 实验材料
化学试剂：雌三醇（E3，纯度≥98%）为上海晶纯试剂公司出品.
供试菌株：Novosphingobium sp.ARI1（革兰氏阴性菌，不产芽孢，好氧，菌体形状为近似杆状（长约1.2 μm，宽约0.8 μm），无鞭毛，不运动。菌落呈圆形，较小，中间隆起，表面湿润光滑，呈奶油色）.
1.2 培养基
R2A培养基：胰蛋白胨0.25 gL1，酸水解酪蛋白0.5gL1，酵母浸粉0.5 gL1，可溶性淀粉0.5 gL1，磷酸氢二钾0.3 gL1，硫酸镁0.1 gL1，丙酮酸钠0.3 gL1，蛋白胨0.25 gL1，葡萄糖0.5 gL1， pH 7.07.4.
雌激素降解培养基：1000 mgL1的雌激素甲醇溶液过0.22 μm滤膜除菌，取一定量置于灭菌的三角瓶中，待甲醇挥发完全后加入灭菌的无机盐培养液，使雌激素的最终浓度达到实验设计浓度.
1.3 雌三醇降解实验
（1）雌三醇降解效率的测定
在雌三醇含量为50mgL1的雌激素降解培养基中，按5%的接种量加入菌悬液(D600值为1.0)，30℃、150rmin1摇床培养7d，每天定时取样，测定培养基的D600值与雌三醇浓度.
雌三醇浓度测定采用整瓶提取的方法，向培养基中加入20ml甲醇，超声振荡30min后，用高效液相色谱法测定雌三醇浓度。高效液相色谱（岛津LC20AT）设定参数为：Inertsil ODSSPC18反相色谱柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm），乙腈/水（体积比为70:30），检测波长为280nm，流速1mL/min，柱温40℃.
（2）环境条件对雌三醇降解效率影响研究
培养条件、接种方法与（1）同，只改变相应环境条件进行雌三醇降解实验.
温度的影响：分别在15、20、25、30、35、40℃条件下摇床培养7d后测定培养基D600和雌三醇浓度.
pH值的影响：雌激素降解培养基pH值分别调至4、5、6、7、8、9、10，摇床培养7d后测定培养基D600和雌三醇浓度.
初始雌三醇浓度的影响：改变初始雌三醇浓度分别为50、100、159、200、250mgL1条件下摇床培养7d后测定培养基D600和雌三醇浓度。
接种量的影响：分别在接种量为5、10、15、20%条件下摇床培养7d后测定培养基D600和雌三醇浓度.
1.4 数据分析
实验所得数据在Microsoft office Excel 中进行处理.
雌三醇降解率=（对照样品中雌三醇浓度处理样品中雌三醇残留浓度）/对照样品中雌三醇浓度x100%
2 结论与讨论
2.1 菌株ARI1对雌三醇降解能力测定
菌株ARI1在培养第一天就呈对数生长，并很快达到最大值。第二天起菌株数量逐渐下降，并呈不断下降趋势。
菌株ARI1对浓度为50 mgL1E3具有较高的降解能力，7d总的降解率高达99%以上。其中，前3d的降解速率较快，前3d总的降解率达到88%，具有较高的实际应用价值。（如图1）
2.2 环境条件对菌株降解雌三醇的影响
2.2.1 温度影响
由图可见，菌株ARI1降解E3具有较广的温度适宜范围，25~35℃降解去除率最高，达到99%。温度偏高或偏低均对菌株的降解能力产生较大不利影响，降解率显著降低。（如图2）
2.2.2 pH影响
菌株ARI1对E3的最适降解pH为7.0，降解率接近100%，弱碱性环境也能达到较高的降解率，均在99%。较强的酸性环境对整体的降解存在不利影响，使降解率相较于中性偏碱性环境略低，但也在97%以上。（如图3）
2.2.3 初始雌三醇浓度影响
当E3的含量处于较低浓度（50~100 mgL1）时ARI1的降解能力很强，降解率接近100%。当E3浓度大于150 mgL1时降解率明显下降。为了能满足较大的E3浓度，同时又能达到较大的降解率，选择50 mgL1作为菌株ARI1降解E3的最适底物浓度。（如图4）
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
引言 3
1 材料与方法 4
1.1 实验材料 4
1.2 培养基 4
1.3 雌三醇降解实验 4
1.4 数据分析 5
2 结论与讨论 6
2.1 菌株ARI1对雌三醇降解能力测定 5
2.2 环境条件对菌株降解雌三醇的影响 6
3 结论 8
4 研究展望 8
致谢 8
参考文献 8
Novosphingobium sp.ARI1对雌三醇的降解特性研究
引言
引言
环境雌激素是指由于自然产生或者人类的生产和生活活动而释放到周围环境中，影响人体和动物体内的正常激素功能及内分泌系统的化学物质[1]。科学家们主要研究了不同环境中的污染物，包括污水处理厂[2]、人工湿地[3]、土壤[4]、河流[56]、地下水和含水层沉淀物[7]、海洋和海洋沉淀物[810]等，结果表明这些环境中都存在不同程度的雌激素污染。
环境雌激素属于类固醇物质，主要由人和动物体内卵巢细胞产生。雌激素根据其结构可分为游离态和结合态，游离态雌激素包括17α雌二醇（17αE2）、17β雌二醇（17βE2）、雌酮（E1）和雌三醇（E3），其中17β雌二醇的雌激素活性最强[11]。
环境雌激素大多为脂溶性，化学性质稳定，可通过食物链富集，进入机体后生物半衰期较长，难以生物降解，不易排出甚至不排
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
出。环境雌激素可干扰机体内分泌系统的功能，影响体内激素的合成、释放、转运、代谢及结合等过程，进而严重影响机体生殖生产，改变机体免疫功能，影响神经细胞的活动及神经系统的传导能力，导致神经系统发育延迟、智力损伤等[12]，对身体各部分机能造成不同程度影响。
本文选择雌三醇为目标物，探索其在不同环境条件下的降解特性，以期为研究雌激素固定化并为后期在水体、粪便中处理雌激素提供支持。
1 材料与方法
1.1 实验材料
化学试剂：雌三醇（E3，纯度≥98%）为上海晶纯试剂公司出品.
供试菌株：Novosphingobium sp.ARI1（革兰氏阴性菌，不产芽孢，好氧，菌体形状为近似杆状（长约1.2 μm，宽约0.8 μm），无鞭毛，不运动。菌落呈圆形，较小，中间隆起，表面湿润光滑，呈奶油色）.
1.2 培养基
R2A培养基：胰蛋白胨0.25 gL1，酸水解酪蛋白0.5gL1，酵母浸粉0.5 gL1，可溶性淀粉0.5 gL1，磷酸氢二钾0.3 gL1，硫酸镁0.1 gL1，丙酮酸钠0.3 gL1，蛋白胨0.25 gL1，葡萄糖0.5 gL1， pH 7.07.4.
雌激素降解培养基：1000 mgL1的雌激素甲醇溶液过0.22 μm滤膜除菌，取一定量置于灭菌的三角瓶中，待甲醇挥发完全后加入灭菌的无机盐培养液，使雌激素的最终浓度达到实验设计浓度.
1.3 雌三醇降解实验
（1）雌三醇降解效率的测定
在雌三醇含量为50mgL1的雌激素降解培养基中，按5%的接种量加入菌悬液(D600值为1.0)，30℃、150rmin1摇床培养7d，每天定时取样，测定培养基的D600值与雌三醇浓度.
雌三醇浓度测定采用整瓶提取的方法，向培养基中加入20ml甲醇，超声振荡30min后，用高效液相色谱法测定雌三醇浓度。高效液相色谱（岛津LC20AT）设定参数为：Inertsil ODSSPC18反相色谱柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm），乙腈/水（体积比为70:30），检测波长为280nm，流速1mL/min，柱温40℃.
（2）环境条件对雌三醇降解效率影响研究
培养条件、接种方法与（1）同，只改变相应环境条件进行雌三醇降解实验.
温度的影响：分别在15、20、25、30、35、40℃条件下摇床培养7d后测定培养基D600和雌三醇浓度.
pH值的影响：雌激素降解培养基pH值分别调至4、5、6、7、8、9、10，摇床培养7d后测定培养基D600和雌三醇浓度.
初始雌三醇浓度的影响：改变初始雌三醇浓度分别为50、100、159、200、250mgL1条件下摇床培养7d后测定培养基D600和雌三醇浓度。
接种量的影响：分别在接种量为5、10、15、20%条件下摇床培养7d后测定培养基D600和雌三醇浓度.
1.4 数据分析
实验所得数据在Microsoft office Excel 中进行处理.
雌三醇降解率=（对照样品中雌三醇浓度处理样品中雌三醇残留浓度）/对照样品中雌三醇浓度x100%
2 结论与讨论
2.1 菌株ARI1对雌三醇降解能力测定
菌株ARI1在培养第一天就呈对数生长，并很快达到最大值。第二天起菌株数量逐渐下降，并呈不断下降趋势。
菌株ARI1对浓度为50 mgL1E3具有较高的降解能力，7d总的降解率高达99%以上。其中，前3d的降解速率较快，前3d总的降解率达到88%，具有较高的实际应用价值。（如图1）
2.2 环境条件对菌株降解雌三醇的影响
2.2.1 温度影响
由图可见，菌株ARI1降解E3具有较广的温度适宜范围，25~35℃降解去除率最高，达到99%。温度偏高或偏低均对菌株的降解能力产生较大不利影响，降解率显著降低。（如图2）
2.2.2 pH影响
菌株ARI1对E3的最适降解pH为7.0，降解率接近100%，弱碱性环境也能达到较高的降解率，均在99%。较强的酸性环境对整体的降解存在不利影响，使降解率相较于中性偏碱性环境略低，但也在97%以上。（如图3）
2.2.3 初始雌三醇浓度影响
当E3的含量处于较低浓度（50~100 mgL1）时ARI1的降解能力很强，降解率接近100%。当E3浓度大于150 mgL1时降解率明显下降。为了能满足较大的E3浓度，同时又能达到较大的降解率，选择50 mgL1作为菌株ARI1降解E3的最适底物浓度。（如图4）
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