自然条件水稻秸秆降解微生物多样性特征的研究
摘要：本研究选择三个野外试验点预埋装入水稻秸秆的尼龙网袋，探讨水稻秸秆还田降解过程中的降解特征及微生物群落的变化。结果表明：通过平板培养试验分离纯化到20株细菌和10株真菌，能在稻杆粉平板上快速生长，均有一定的稻杆降解能力，通过16S和ITS测序鉴定这些细菌分别为JB-7球形赖氨酸芽孢杆菌,真菌分别为JW黄曲霉；摇瓶试验所筛选的真菌有较强的腐解能力。三个不同地区所分离出的可培养的降解稻杆的真菌的优势菌的种类一致主要是曲霉类，秸秆的降解过程菌种组成基本维持一个此消彼长的过程，即既有新菌的出现，也会出现部分菌种的消失，且新菌种的出现有可能改变某一阶段优势菌的组成。不同的环境中，降解秸秆菌种的组成会有各自不同的特点，尤其是在降解的中期会出现各自适应于不同环境的新菌种。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法 2
1.1材料 2
1.1.1供试稻杆样品来源2
1.1.2采样点及采样方法2
1.1.3培养基2
1.2样品分析及方法3
1.2.1三个试验点土壤理化指标测定3
1.2.2三个试验点不同时期腐解稻杆降解率的动态变化3
1.2.3三个试验点不同时期腐解稻杆主成分的动态变化 3
2结果4
2.1三个试验点土壤理化指标测定4
2.1.1试验点土壤背景值测定4
2.1.2不同采样时期，网际土壤、腐解稻杆碳氮比变化4
2.2三个试验点不同时期腐解稻杆降解率的动态变化5
2.3腐解进程中稻杆内木质纤维素类物质含量的变化6
2.4菌株富集结果7
2.4.1可培养细菌数量和真菌数量7
2.4.2筛选单菌落8
2.5相对降解率测定10
3讨论11
致谢11
参考文献12
自然条件水稻秸秆降解微生物多样性特征的研究
引言
引言 生物质燃烧现在被公认为是一个重要的全球排放源，是大气总二氧化碳的40%的来源[1]。据估
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
计，每年总共约8700 Tg的干物质被燃烧，并且90%的生物质燃烧是人类造成的[2]。因此，秸秆还田对于改善环境显得十分重要。
秸秆直接还田是保护性耕作技术的关键技术措施之一，能够把作物吸收的大部分营养元素归还到土壤，是农业可持续发展的重要途径[3]，如果将我国每年产生的秸秆做成有机肥料或秸秆直接还田，相当于300多万吨氮肥，700多万吨钾肥，70多万吨磷肥，相当于我国每年化肥总用量的1/4，是一笔相当可观的肥料资源[4]。但是大量试验证明仅仅依靠简单的直接还田，秸秆不能快速降解，某些病菌在秸秆上滋生，使病害率增加，给农业生产带来许多不利影响[5]，在还田过程中补加纤维素降解菌剂是解决其不利影响的有效方法，加快秸秆物料中纤维素的分解速度，是提高秸秆降解率，促进秸秆还田技术推广的关键[6]。因此，筛选高效秸秆纤维素降解菌是亟待解决的问题。由于环境中的微生物具有增殖速度快、功能丰富多样、适应性强等特点,应用微生物学方法腐解处理秸秆具有其他物理化学方法不可替代的优点[7]，在国内外的研究表明，腐烂废弃物通过环境中的微生物的分泌纤维素酶从而分解废弃物，其中研究较为成熟的包括：木霉属、曲霉菌属、青霉菌属、漆斑菌属、脉孢菌属、担子菌属、根霉菌属、毛壳菌属等[813]，通过微生物的降解作用可以促进秸秆堆腐，减少秸秆直接还田的危害。本研究主要探讨水稻秸秆还田降解过程中的降解特征及微生物群落的变化。本研究通过选择不同野外试验点（分别为八卦洲、麒麟镇、紫金山）填埋水稻秸秆的方法，定期取样，研究水稻不同时期腐解特性以及微生物变化特征，从试验中筛选在腐解秸秆中富集具有降解木质纤维素能力的真菌和细菌，了解微生物参与秸秆降解过程中的角色，真菌和细菌如何有效地协同作用。充分了解稻杆还田的降解特性以及相应功能降解菌的协同降解机理，为后期开发高效稻杆腐解菌剂具有重要意义[14]。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试稻秆样品来源
供试稻秆样品取材于盐城的水稻秸秆，将风干稻秆切成1 cm大小的秸秆段，每个网袋装入10 g。
1.1.2 采样点及采样方法
试验点选择分别为南京紫金山、南京八卦洲和南京麒麟镇农场等自然环境中，将网袋填埋于10cm深度排列开。样品采集安排为第0周（0），第2周（2），第4周（4），第6周（6），第8周（8），第12周（12），第16周（16），每次采样取三个重复网袋以及网袋周围土壤。样品混匀，带回实验室后去掉植物根系和碎片等侵入体，过2 mm筛后，一部分用于理化测定和筛菌，一部分保藏于70℃冰箱，以备后期DNA提取，分析微生物群落结构。
图 11 试验点分布及样品布置
Fig.11 The experiment sites and the rice straw sample put into the soil
1.1.3 培养基
腐解稻秆浸提液：取腐解稻秆新鲜样品1 g于50 mL离心管，加入10 mL水，振荡30 min（170 r/min），取出，静止10 min，取1 mL上清液于2 mL离心管，梯度稀释为101，102，103，104，105，106。
Mandels营养液：(NH4)2SO4 1.4 g，KH2PO4 2.0 g，尿素0.3 g，微量元素（MgSO47H2O 0.3 g，CaC120.3 g，FeSO47H2O 7.5 mg，MnSO4H2O 2.5 mg，ZnSO4 2.0 mg，CoC12 3.0 mg）, 去离子水1 L。
稻秆粉培养基参照文献，略作改动：稻秆粉2 g、Mandels营养液1 L。
羧甲基纤维素钠培养基参照文献，略作改动：CMCNa 10 g、Mandels营养液1 L。
LB培养基：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g、琼脂20 g、去离子水1 L，pH自然。
PDA培养基：去皮马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂20 g、去离子水1 L，pH自然。
固体培养基分别加入20 g/L的固体琼脂，以上培养基均在121 ℃条件下灭菌30 min。
1.2 样品分析及方法
1.2.1 三个试验点土壤理化指标测定
土壤含水率采用烘干法测定；pH值采用电位法(GB785987）测定；有机质含量采用重铬酸钾氧化外加热法(GB785787）测定；全氮含量采用元素分析仪测定；速效磷含量采用钼锑抗比色法(GB785387）测定；有效钾采用乙酸铵浸提火焰光度法(GB785687）测定。土壤粒径分析通过高精度粒度分析仪测定。
1.2.2 三个试验点不同时期腐解稻秆降解率的动态变化
将每次取回的秸秆样品，经过水洗，去除表面的沙粒杂物，将降解剩余物料置于75 ℃烘箱中至质量恒定。计算秸秆降解率（Relatively degradation rate, RDR）。
RDR = × 100%
M0为初始稻秆干物料质量10 g，M1为填埋腐解稻秆剩余干物料质量。
1.2.3 三个试验点不同时期腐解稻秆主成分的动态变化
将不同时期腐解秸秆样品风干后，研磨至2 mm大小，选择球磨仪进行研磨，秸秆样品全碳、全氮采用元素分析仪测定，按照仪器使用方法进行。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法 2
1.1材料 2
1.1.1供试稻杆样品来源2
1.1.2采样点及采样方法2
1.1.3培养基2
1.2样品分析及方法3
1.2.1三个试验点土壤理化指标测定3
1.2.2三个试验点不同时期腐解稻杆降解率的动态变化3
1.2.3三个试验点不同时期腐解稻杆主成分的动态变化 3
2结果4
2.1三个试验点土壤理化指标测定4
2.1.1试验点土壤背景值测定4
2.1.2不同采样时期，网际土壤、腐解稻杆碳氮比变化4
2.2三个试验点不同时期腐解稻杆降解率的动态变化5
2.3腐解进程中稻杆内木质纤维素类物质含量的变化6
2.4菌株富集结果7
2.4.1可培养细菌数量和真菌数量7
2.4.2筛选单菌落8
2.5相对降解率测定10
3讨论11
致谢11
参考文献12
自然条件水稻秸秆降解微生物多样性特征的研究
引言
引言 生物质燃烧现在被公认为是一个重要的全球排放源，是大气总二氧化碳的40%的来源[1]。据估
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
计，每年总共约8700 Tg的干物质被燃烧，并且90%的生物质燃烧是人类造成的[2]。因此，秸秆还田对于改善环境显得十分重要。
秸秆直接还田是保护性耕作技术的关键技术措施之一，能够把作物吸收的大部分营养元素归还到土壤，是农业可持续发展的重要途径[3]，如果将我国每年产生的秸秆做成有机肥料或秸秆直接还田，相当于300多万吨氮肥，700多万吨钾肥，70多万吨磷肥，相当于我国每年化肥总用量的1/4，是一笔相当可观的肥料资源[4]。但是大量试验证明仅仅依靠简单的直接还田，秸秆不能快速降解，某些病菌在秸秆上滋生，使病害率增加，给农业生产带来许多不利影响[5]，在还田过程中补加纤维素降解菌剂是解决其不利影响的有效方法，加快秸秆物料中纤维素的分解速度，是提高秸秆降解率，促进秸秆还田技术推广的关键[6]。因此，筛选高效秸秆纤维素降解菌是亟待解决的问题。由于环境中的微生物具有增殖速度快、功能丰富多样、适应性强等特点,应用微生物学方法腐解处理秸秆具有其他物理化学方法不可替代的优点[7]，在国内外的研究表明，腐烂废弃物通过环境中的微生物的分泌纤维素酶从而分解废弃物，其中研究较为成熟的包括：木霉属、曲霉菌属、青霉菌属、漆斑菌属、脉孢菌属、担子菌属、根霉菌属、毛壳菌属等[813]，通过微生物的降解作用可以促进秸秆堆腐，减少秸秆直接还田的危害。本研究主要探讨水稻秸秆还田降解过程中的降解特征及微生物群落的变化。本研究通过选择不同野外试验点（分别为八卦洲、麒麟镇、紫金山）填埋水稻秸秆的方法，定期取样，研究水稻不同时期腐解特性以及微生物变化特征，从试验中筛选在腐解秸秆中富集具有降解木质纤维素能力的真菌和细菌，了解微生物参与秸秆降解过程中的角色，真菌和细菌如何有效地协同作用。充分了解稻杆还田的降解特性以及相应功能降解菌的协同降解机理，为后期开发高效稻杆腐解菌剂具有重要意义[14]。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试稻秆样品来源
供试稻秆样品取材于盐城的水稻秸秆，将风干稻秆切成1 cm大小的秸秆段，每个网袋装入10 g。
1.1.2 采样点及采样方法
试验点选择分别为南京紫金山、南京八卦洲和南京麒麟镇农场等自然环境中，将网袋填埋于10cm深度排列开。样品采集安排为第0周（0），第2周（2），第4周（4），第6周（6），第8周（8），第12周（12），第16周（16），每次采样取三个重复网袋以及网袋周围土壤。样品混匀，带回实验室后去掉植物根系和碎片等侵入体，过2 mm筛后，一部分用于理化测定和筛菌，一部分保藏于70℃冰箱，以备后期DNA提取，分析微生物群落结构。
图 11 试验点分布及样品布置
Fig.11 The experiment sites and the rice straw sample put into the soil
1.1.3 培养基
腐解稻秆浸提液：取腐解稻秆新鲜样品1 g于50 mL离心管，加入10 mL水，振荡30 min（170 r/min），取出，静止10 min，取1 mL上清液于2 mL离心管，梯度稀释为101，102，103，104，105，106。
Mandels营养液：(NH4)2SO4 1.4 g，KH2PO4 2.0 g，尿素0.3 g，微量元素（MgSO47H2O 0.3 g，CaC120.3 g，FeSO47H2O 7.5 mg，MnSO4H2O 2.5 mg，ZnSO4 2.0 mg，CoC12 3.0 mg）, 去离子水1 L。
稻秆粉培养基参照文献，略作改动：稻秆粉2 g、Mandels营养液1 L。
羧甲基纤维素钠培养基参照文献，略作改动：CMCNa 10 g、Mandels营养液1 L。
LB培养基：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g、琼脂20 g、去离子水1 L，pH自然。
PDA培养基：去皮马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂20 g、去离子水1 L，pH自然。
固体培养基分别加入20 g/L的固体琼脂，以上培养基均在121 ℃条件下灭菌30 min。
1.2 样品分析及方法
1.2.1 三个试验点土壤理化指标测定
土壤含水率采用烘干法测定；pH值采用电位法(GB785987）测定；有机质含量采用重铬酸钾氧化外加热法(GB785787）测定；全氮含量采用元素分析仪测定；速效磷含量采用钼锑抗比色法(GB785387）测定；有效钾采用乙酸铵浸提火焰光度法(GB785687）测定。土壤粒径分析通过高精度粒度分析仪测定。
1.2.2 三个试验点不同时期腐解稻秆降解率的动态变化
将每次取回的秸秆样品，经过水洗，去除表面的沙粒杂物，将降解剩余物料置于75 ℃烘箱中至质量恒定。计算秸秆降解率（Relatively degradation rate, RDR）。
RDR = × 100%
M0为初始稻秆干物料质量10 g，M1为填埋腐解稻秆剩余干物料质量。
1.2.3 三个试验点不同时期腐解稻秆主成分的动态变化
将不同时期腐解秸秆样品风干后，研磨至2 mm大小，选择球磨仪进行研磨，秸秆样品全碳、全氮采用元素分析仪测定，按照仪器使用方法进行。
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