共生细菌对小球藻砷酸盐富集影响的研究
摘要：砷（As）是一种有毒的类金属元素，在自然界分布广泛，而不合理的人类活动更是极大地增加了环境中的砷含量，加剧了砷污染。针对此情况，本课题利用生长速度快、可对废水进行生物修复的小球藻作为实验材料，并将小球藻和其共生细菌共同培养，利用菌藻共生体的高吸附、低成本等特点，开展共生细菌对小球藻砷富集影响的研究，以期能够明确细菌对小球藻生长特性的影响，阐明小球藻-细菌共生体对砷酸盐的富集情况。通过本课题进行的一系列实验，对于除菌小球藻以及菌藻共生体对于砷酸盐的富集情况有如下结论：除菌小球藻>菌藻共生体。本研究结果对于含砷水体的污染治理以及降低砷的环境风险具有重要意义，并为使用菌藻共生体处理环境中其他污染物的研究提供有效的参考。
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 2
Key words 2
引言 2
1 材料与方法 3
1．1 材料 3
1．2 方法 3
1．2．1 小球藻细菌共生体的构建及生长特性的研究 3
1．2．1．1 小球藻的培养条件 3
1．2．1．2 共生细菌的分离和鉴定 3
1．2．1．3 小球藻的除菌纯化 3
1．2．1．4 菌藻共生体的构建 3
1．2．2 菌藻共生体对砷的富集研究 3
1．2．2．1 除菌和带菌小球藻对砷的富集 3
1．2．2．2 砷的测定 4
1．2．2．3 数据分析处理 4
2 结果与分析 4
2．1 不同浓度As（V）胁迫下除菌小球藻对砷的富集情况研究 4
2．1．1 As（V）对除菌小球藻生长情况的影响 4
2．1．2 小球藻富集砷总量的测定 4
2．2 不同浓度As（V）胁迫下耐砷细菌对砷的富集情况研究 5
2．3 不同浓度As（V）胁迫下菌藻共生体对砷的富集情况研究 6
3 讨论 7
3．1 除菌小球藻和耐砷细菌对As（V）的富集特点 7
3．2 菌藻共生体对As（V）的富集特点 7
4 结
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
论 7
致谢 7
参考文献 8
共生细菌对小球藻砷酸盐富集影响的研究
引言
引言
砷（As）是一种有毒的类金属元素，在自然界分布广泛，于大气、土壤、岩石、天然水和生物体中均有发现[1]。已有报道表明，采矿、燃烧化石燃料、使用农药、杀虫剂等人类活动极大地增加了环境中砷的含量[2]，加剧环境的砷污染。环境中砷存在不同的化学形态，包括As（Ⅴ），As（Ⅲ），As（0）和As（Ⅲ）。在自然水体系中，总可溶性的砷主要是以砷酸盐（As（Ⅴ））和亚砷酸盐（As（Ⅲ））的无机形态存在[1]。此外，存在少量一甲基砷酸（MMAA），二甲基砷酸（DMAA）与三甲基氧化砷（TMAO）等有机砷化合物；由于微生物、人和动物可将无机形态的砷甲基化[3]，甲基化形态亦可存在于有机体内。
由于微藻具有生长速度快、含油量高、可对废水进行生物修复等优点，近年来微藻资源利用引起广泛关注[4]。作为海洋和淡水生态系统中的初级生产者，微藻对维护水环境生态平衡具有重要作用[5]。微藻细胞比表面积大，对无机砷的吸附、吸收能力强，在处理砷污染废水方面具有极大的潜力[6,7]。而小球藻是自然界中最多、最常见的藻类，容易生长，繁殖快，具有较大的细胞表面积[8]，故常在科研中作为实验材料。
基于微生物间代谢互补的共生想法首次得到应用是在1958年，将微藻与细菌共同培养，用于改善废水处理氧化塘中氧气的供应状况。藻菌共生，结合了微藻较高的吸附能力和细菌较低成本培养的优势，逐渐成为环境应用领域极有竞争优势的吸附剂[9]。近年来，利用微藻与细菌的共生在处理污水方面已有研究，被开发为生物滤器、生物反应器等装置，主要用于处理污水中的重金属、有机污染物、氮磷等[10,11,12]。细菌的存在可影响重金属对微藻的毒性。有研究表明，当小球藻与细菌形成共生体，受到重金属铜胁迫时，共生细菌的存在可降低铜对小球藻的毒害作用，这可能是由于在重金属胁迫下，细菌增加了小球藻细胞的表面积，提供了更多与铜的结合位点，从而降低对小球藻的毒性[13]。
研究表明，藻菌共生不仅对降解污水中的有机污染物和氮、磷等营养物质效果明显，微藻细菌共生系统对水体中铜、锌等重金属的去除效果良好[14]。本实验通过开展共生细菌对小球藻砷酸盐富集影响的研究，以期能够明确细菌对小球藻生长特性的影响，阐明小球藻细菌共生体对砷酸盐富集情况的影响。本研究结果将为使用菌藻共生体处理环境中其他污染物的研究提供有效的参考，同时对于含砷水体的污染治理以及降低砷的环境风险具有重要意义。
1 材料与方法
1．1 材料
供试材料为于自然界广泛分布的常见绿藻（Chlorophyta）小球藻（Chlorella salina）和与其共生的一株细菌，该细菌的鉴定步骤和结果见如下描述。
1．2 方法
1．2．1 小球藻细菌共生体的构建及生长特性的研究
1．2．1．1 小球藻的培养条件
以一株长期与细菌共生培养的小球藻为试验材料，使用f/2培养基，使用20 mmol/L的4羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）控制pH为8.0±0.2，培养条件为白天30±1℃，夜晚25±1℃，光周期比为12:12 h，光强为4000 lx。
1．2．1．2 共生细菌的分离和鉴定
对于长期培养的含细菌的小球藻培养体系，分别使用5 mg/L、10 mg/L和20 mg/L的As（Ⅴ）处理，培养7d后，1500g离心5min，取0.2 mL上清液进行涂布平板（LB），于30℃恒温培养箱中倒置培养，至菌落形成后，挑取单菌落于LB琼脂平板分离纯化，显微镜初步观察只有一种菌落形态。
通过16S rRNA序列测定鉴定细菌，主要步骤如下：提取细菌DNA基因组→16S rRNA PCR克隆→PCR产物琼脂糖电泳回收→测序→NCBI比对同源性。
1．2．1．3 小球藻的除菌纯化
使用氨苄青霉素、庆大霉素、硫酸卡那霉素去除带菌小球藻培养液中的细菌，将三种抗生素配置成母液，使用0.2 μm滤膜过滤去除细菌。取定量加至小球藻培养液中，培养3d后，继续加以同等的抗生素处理。对除菌小球藻划平板以确定没有细菌。对除菌的小球藻的进行传代培养，以消除抗生素的影响。
1．2．1．4 菌藻共生体的构建
将从小球藻中分离出的细菌和除菌的小球藻各自在异养和自养培养基中培养一段时间，离心细菌培养液以去除异养培养基；将所得共生细菌经清洗后，重新在自养培养基中分散培养，适应后用于后续共生培养。共生细菌培养液和小球藻培养液按1:1的混合后继续培养，形成小球藻细菌共生体系。
1．2．2 菌藻共生体对砷的富集研究
1．2．2．1 除菌和带菌小球藻对砷的富集
本实验共设置0.757.5 mg/L 5个不同的As（Ⅴ）浓度梯度，同时设置空白对照组（不加砷），每个处理3个平行，每个平行测定2次结果（OD680）。将除菌小球藻分装于250mL三角瓶中，生长至对数期中期后，设置系列浓度的As（Ⅴ）处理，使之总体积为100 mL，并设置空白对照组(不加砷处理)和试剂空白对照（未添加小球藻），每个浓度处理3个平行试验，每天在相同的时间取样测定OD680确定生长状况，培养收获后离心收获除菌小球藻细胞，并收集上清液；共生细菌离心收获后收集上清液。
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 2
Key words 2
引言 2
1 材料与方法 3
1．1 材料 3
1．2 方法 3
1．2．1 小球藻细菌共生体的构建及生长特性的研究 3
1．2．1．1 小球藻的培养条件 3
1．2．1．2 共生细菌的分离和鉴定 3
1．2．1．3 小球藻的除菌纯化 3
1．2．1．4 菌藻共生体的构建 3
1．2．2 菌藻共生体对砷的富集研究 3
1．2．2．1 除菌和带菌小球藻对砷的富集 3
1．2．2．2 砷的测定 4
1．2．2．3 数据分析处理 4
2 结果与分析 4
2．1 不同浓度As（V）胁迫下除菌小球藻对砷的富集情况研究 4
2．1．1 As（V）对除菌小球藻生长情况的影响 4
2．1．2 小球藻富集砷总量的测定 4
2．2 不同浓度As（V）胁迫下耐砷细菌对砷的富集情况研究 5
2．3 不同浓度As（V）胁迫下菌藻共生体对砷的富集情况研究 6
3 讨论 7
3．1 除菌小球藻和耐砷细菌对As（V）的富集特点 7
3．2 菌藻共生体对As（V）的富集特点 7
4 结
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
论 7
致谢 7
参考文献 8
共生细菌对小球藻砷酸盐富集影响的研究
引言
引言
砷（As）是一种有毒的类金属元素，在自然界分布广泛，于大气、土壤、岩石、天然水和生物体中均有发现[1]。已有报道表明，采矿、燃烧化石燃料、使用农药、杀虫剂等人类活动极大地增加了环境中砷的含量[2]，加剧环境的砷污染。环境中砷存在不同的化学形态，包括As（Ⅴ），As（Ⅲ），As（0）和As（Ⅲ）。在自然水体系中，总可溶性的砷主要是以砷酸盐（As（Ⅴ））和亚砷酸盐（As（Ⅲ））的无机形态存在[1]。此外，存在少量一甲基砷酸（MMAA），二甲基砷酸（DMAA）与三甲基氧化砷（TMAO）等有机砷化合物；由于微生物、人和动物可将无机形态的砷甲基化[3]，甲基化形态亦可存在于有机体内。
由于微藻具有生长速度快、含油量高、可对废水进行生物修复等优点，近年来微藻资源利用引起广泛关注[4]。作为海洋和淡水生态系统中的初级生产者，微藻对维护水环境生态平衡具有重要作用[5]。微藻细胞比表面积大，对无机砷的吸附、吸收能力强，在处理砷污染废水方面具有极大的潜力[6,7]。而小球藻是自然界中最多、最常见的藻类，容易生长，繁殖快，具有较大的细胞表面积[8]，故常在科研中作为实验材料。
基于微生物间代谢互补的共生想法首次得到应用是在1958年，将微藻与细菌共同培养，用于改善废水处理氧化塘中氧气的供应状况。藻菌共生，结合了微藻较高的吸附能力和细菌较低成本培养的优势，逐渐成为环境应用领域极有竞争优势的吸附剂[9]。近年来，利用微藻与细菌的共生在处理污水方面已有研究，被开发为生物滤器、生物反应器等装置，主要用于处理污水中的重金属、有机污染物、氮磷等[10,11,12]。细菌的存在可影响重金属对微藻的毒性。有研究表明，当小球藻与细菌形成共生体，受到重金属铜胁迫时，共生细菌的存在可降低铜对小球藻的毒害作用，这可能是由于在重金属胁迫下，细菌增加了小球藻细胞的表面积，提供了更多与铜的结合位点，从而降低对小球藻的毒性[13]。
研究表明，藻菌共生不仅对降解污水中的有机污染物和氮、磷等营养物质效果明显，微藻细菌共生系统对水体中铜、锌等重金属的去除效果良好[14]。本实验通过开展共生细菌对小球藻砷酸盐富集影响的研究，以期能够明确细菌对小球藻生长特性的影响，阐明小球藻细菌共生体对砷酸盐富集情况的影响。本研究结果将为使用菌藻共生体处理环境中其他污染物的研究提供有效的参考，同时对于含砷水体的污染治理以及降低砷的环境风险具有重要意义。
1 材料与方法
1．1 材料
供试材料为于自然界广泛分布的常见绿藻（Chlorophyta）小球藻（Chlorella salina）和与其共生的一株细菌，该细菌的鉴定步骤和结果见如下描述。
1．2 方法
1．2．1 小球藻细菌共生体的构建及生长特性的研究
1．2．1．1 小球藻的培养条件
以一株长期与细菌共生培养的小球藻为试验材料，使用f/2培养基，使用20 mmol/L的4羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）控制pH为8.0±0.2，培养条件为白天30±1℃，夜晚25±1℃，光周期比为12:12 h，光强为4000 lx。
1．2．1．2 共生细菌的分离和鉴定
对于长期培养的含细菌的小球藻培养体系，分别使用5 mg/L、10 mg/L和20 mg/L的As（Ⅴ）处理，培养7d后，1500g离心5min，取0.2 mL上清液进行涂布平板（LB），于30℃恒温培养箱中倒置培养，至菌落形成后，挑取单菌落于LB琼脂平板分离纯化，显微镜初步观察只有一种菌落形态。
通过16S rRNA序列测定鉴定细菌，主要步骤如下：提取细菌DNA基因组→16S rRNA PCR克隆→PCR产物琼脂糖电泳回收→测序→NCBI比对同源性。
1．2．1．3 小球藻的除菌纯化
使用氨苄青霉素、庆大霉素、硫酸卡那霉素去除带菌小球藻培养液中的细菌，将三种抗生素配置成母液，使用0.2 μm滤膜过滤去除细菌。取定量加至小球藻培养液中，培养3d后，继续加以同等的抗生素处理。对除菌小球藻划平板以确定没有细菌。对除菌的小球藻的进行传代培养，以消除抗生素的影响。
1．2．1．4 菌藻共生体的构建
将从小球藻中分离出的细菌和除菌的小球藻各自在异养和自养培养基中培养一段时间，离心细菌培养液以去除异养培养基；将所得共生细菌经清洗后，重新在自养培养基中分散培养，适应后用于后续共生培养。共生细菌培养液和小球藻培养液按1:1的混合后继续培养，形成小球藻细菌共生体系。
1．2．2 菌藻共生体对砷的富集研究
1．2．2．1 除菌和带菌小球藻对砷的富集
本实验共设置0.757.5 mg/L 5个不同的As（Ⅴ）浓度梯度，同时设置空白对照组（不加砷），每个处理3个平行，每个平行测定2次结果（OD680）。将除菌小球藻分装于250mL三角瓶中，生长至对数期中期后，设置系列浓度的As（Ⅴ）处理，使之总体积为100 mL，并设置空白对照组(不加砷处理)和试剂空白对照（未添加小球藻），每个浓度处理3个平行试验，每天在相同的时间取样测定OD680确定生长状况，培养收获后离心收获除菌小球藻细胞，并收集上清液；共生细菌离心收获后收集上清液。
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