螺旋藻对砷的吸收和代谢的研究
摘要：为研究不同浓度As(Ⅲ)和As(Ⅴ)处理下螺旋藻对砷的吸收和代谢特性,本试验用0~300 μg·L-1As(Ⅲ)或As(Ⅴ)处理螺旋藻，通过对其生物量的测定，阐明不同浓度的As(Ⅲ)、As(Ⅴ)对螺旋藻生长的影响，并通过螺旋藻体内总砷含量和砷形态的测定，阐明螺旋藻对不同形态砷的吸收和代谢。结果表明，相同砷浓度(0~300 μg·L-1)下, As(Ⅴ)对螺旋藻的生长几乎没有影响，As(Ⅲ)有促进藻体生物量增加的趋势。50、100 μg·L-1 As(Ⅴ)处理时藻体几乎不吸收As；相同As浓度处理时，As(Ⅲ)处理的藻内As吸收量比As(Ⅴ)处理时多。此外，As(Ⅴ)处理的螺旋藻胞内仅存在As(Ⅴ)一种砷形态；As(Ⅲ)处理3d后，螺旋藻能将培养基中的As(Ⅲ)几乎氧化为As(Ⅴ)，As(Ⅲ)处理的螺旋藻胞内砷形态以As(Ⅴ)为主，As(Ⅲ)含量约为As(Ⅴ)的1/10。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 供试材料 2
1.2 试验设计 2
1. 2. 1 生物量测定2
1. 2. 2 藻体吸收的总砷含量测定2
1. 2. 3 砷形态提取及测定2
1.3 试验方案 2
1.4 数据处理 2
2 结果与分析2
2.1 As(Ⅲ)、As(Ⅴ)对螺旋藻生长的影响2
2．1．1 As(Ⅲ)对螺旋藻生物量的影响3
2．1．2 As(Ⅴ)对螺旋藻生物量的影响3
2.2 螺旋藻对As(Ⅲ)、As(Ⅴ)的吸收和代谢3
2．2．1 螺旋藻对不同浓度As(Ⅲ)、As(Ⅴ)的吸收3
2．2．2 螺旋藻对不同浓度As(Ⅲ)、As(Ⅴ)的代谢4
3 讨论 5
4 结论 5
致谢5
参考文献6
图1 不同浓度As(Ⅲ)处理下螺旋藻的生物量3
图2 不同浓度As(Ⅴ)处理下螺旋藻的生物量3
图3 300μg
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
L1 As(Ⅲ)处理下的螺旋藻培养基中的As(Ⅴ)比例 3
表1 螺旋藻对不同浓度As(Ⅲ)、As(Ⅴ)的吸收量4
表2 不同浓度As(Ⅲ)处理下螺旋藻胞内各砷形态4
螺旋藻对砷的吸收和代谢的研究
引言
引言：砷普遍存在于自然界中，其毒性极强，且无色无味。作为一个全球性的公共问题，环境中的砷污染已经严重威胁了人类的健康[1]。早在2004年，就有统计表明我国已有超过3万名被证实砷中毒的病患[2]。影响砷的生物毒性的主要因素包括其浓度，以及其存在形态[3]。砷常以砷酸盐或亚砷酸盐的形态存在于自然水体中。近年来，地表、地下水及饮用水中已被发现有大量的人为来源加上自然来源的砷[4]，造成严重的水体砷污染。此外，如果水体遭受砷污染，可能导致微藻从养殖环境中积累大量砷，威胁保健品安全。
螺旋藻是地球上最古老的光合生物之一，它是一种单细胞丝状蓝藻，长约200~500μm[5.6]。螺旋藻目前已成为开发和利用价值最大的经济微藻之一[7],已被推荐为或者规定为一种安全型、营养型、保健型的全能保健食品。在2012年国家食品药品监督管理局以螺旋藻为原料保健食品展开的铅、砷、汞重金属专项监测中，有结果显示产品中铅、砷超过国家保健食品铅和总砷限量标准[8]。
国内外已有不少学者研究不同藻类对砷的吸收转化特性或抗性。许多研究表明，不同的藻类在不同形态、不同浓度的砷胁迫下会产生不同的代谢机制[34,9]。此外，作为水体的初级生产者，藻类能对砷高效累积并提升其向食物链的转移[10]，当藻体积累的砷超过国家标准限量（1.0 mgkg1）[8]时，可能对人体健康产生威胁。
目前国内外对螺旋藻研究主要集中在Cd、Cr、Pb、Cu等多种高浓度重金元素抑制螺旋藻的生长，并在藻体内富集[1115]。有关螺旋藻对砷的吸收和代谢的研究仍鲜有报道。因此，本课题通过不同形态和浓度的砷处理螺旋藻，研究螺旋藻对砷的吸收、转化特性，以期为螺旋藻砷污染的控制提供依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
试验藻种为钝顶螺旋藻（Spirulina platensis）购自山东青岛中国科学院海洋生物种质库，采用Zarrouk培养液培养（pH调节至9.0，121 ℃高压蒸汽灭菌30 min）[16]，光照强度为3500~4000 lux，光照明暗比 12h:12h，培养期间每天定时摇匀3次。
1.2 试验设计
将生长至对数期的螺旋藻接种于1 L锥形瓶中，接种初始OD560nm约为0.2。之后分别取200 mL藻液于500 mL锥形瓶中，加入浓度为50、100、200、300 μgL1的 As(Ⅲ)（以NaAsO2进行配制）或As(Ⅴ)母液（以Na3AsO412H2O配制）进行处理。每个处理设置3个平行，并以不加砷的藻液作为空白对照。处理7 d后用快速滤纸过滤收获藻体，用0.1 molL1 PBS（pH=7.0）清洗（每次5 mL冲洗3次），去除藻细胞表面吸附的砷[17]，再经冷冻干燥后测定藻内吸收的砷含量及其形态.本研究预实验结果表明，PBS不会对藻细胞的完整性产生影响。
1.2.1 生物量测定 螺旋藻经As(Ⅲ)和As(Ⅴ)处理7 d后，用快速滤纸过滤收集藻体，并冷冻干燥24 h。滤纸和藻体的质量与过滤前滤纸的质量之差即为螺旋藻的生物量。同时将未过滤藻液的滤纸同批次冷冻干燥，避免滤纸水分造成的误差。
1.2.2 藻体吸收的总砷含量测定 将冷冻干燥后的螺旋藻样磨碎，称量约0.05 g样品于25 mL玻璃消煮管中，加入2 mL 体积比为4:1的HNO3:HClO4混合酸，静置过夜[18]。采用Lab Tech ED54型智能样品消解仪（莱伯泰科有限公司）电热消解至溶液澄清透明，打开消煮管塞进行赶酸至消煮管内剩下0.2 mL左右液体时，取出消煮管静置冷却。用去离子水润洗移至10 mL容量瓶中，加0.5 mL浓盐酸（优级纯）和2 mL 5%硫脲+5%抗坏血酸混合溶液后定容。采用氢化物发生双道原子荧光光度计（HGAFS，北京吉天仪器有限公司）测定其总砷含量，以同批次藻样相同步骤加标消解进行加标回收，回收率为93.24%~107.27%。
1.2.3 砷形态提取及测定 准确称取0.05 g干样于10 mL离心管中，加入3 mL 0.28 molL1 HNO3进行提取，90 ℃超声10 min后14000 g离心10 min，重复提取3次[18]，上清液合并后定容至10 mL。定容后的样品用0.22 μm滤膜过滤，滤液过阴离子交换柱（Hamilton PRPX100），采用高效液相氢化物发生原子荧光（HPLCHGAFS，北京吉天仪器有限公司）测定螺旋藻中砷的形态。同时设置As(Ⅲ)、一甲基砷（MMA）、二甲基砷（DMA）、As(V)的加标回收实验，砷形态提取率为94.73%~134.23%。检测条件如下[19]：流动相为17.5 mmolL1磷酸氢二铵（pH=6.1），等度洗脱；进样体积100 μL；载流：5%盐酸；还原剂：1.5%硼氢化钾＋0.5%氢氧化钾；屏蔽气：700 mLmin1；载气：Ar，600 mLmin1；光电倍增管电压：270 V；灯电流：100 mA。
1.3 数据处理
运用Excel 2010和SPSS 20统计分析软件进行数据处理与分析，用Excel作图。采用单因素方差分析（Oneway ANOVA）和Tukey检验进行差异显著性分析（p<0.05）。
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 供试材料 2
1.2 试验设计 2
1. 2. 1 生物量测定2
1. 2. 2 藻体吸收的总砷含量测定2
1. 2. 3 砷形态提取及测定2
1.3 试验方案 2
1.4 数据处理 2
2 结果与分析2
2.1 As(Ⅲ)、As(Ⅴ)对螺旋藻生长的影响2
2．1．1 As(Ⅲ)对螺旋藻生物量的影响3
2．1．2 As(Ⅴ)对螺旋藻生物量的影响3
2.2 螺旋藻对As(Ⅲ)、As(Ⅴ)的吸收和代谢3
2．2．1 螺旋藻对不同浓度As(Ⅲ)、As(Ⅴ)的吸收3
2．2．2 螺旋藻对不同浓度As(Ⅲ)、As(Ⅴ)的代谢4
3 讨论 5
4 结论 5
致谢5
参考文献6
图1 不同浓度As(Ⅲ)处理下螺旋藻的生物量3
图2 不同浓度As(Ⅴ)处理下螺旋藻的生物量3
图3 300μg
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
L1 As(Ⅲ)处理下的螺旋藻培养基中的As(Ⅴ)比例 3
表1 螺旋藻对不同浓度As(Ⅲ)、As(Ⅴ)的吸收量4
表2 不同浓度As(Ⅲ)处理下螺旋藻胞内各砷形态4
螺旋藻对砷的吸收和代谢的研究
引言
引言：砷普遍存在于自然界中，其毒性极强，且无色无味。作为一个全球性的公共问题，环境中的砷污染已经严重威胁了人类的健康[1]。早在2004年，就有统计表明我国已有超过3万名被证实砷中毒的病患[2]。影响砷的生物毒性的主要因素包括其浓度，以及其存在形态[3]。砷常以砷酸盐或亚砷酸盐的形态存在于自然水体中。近年来，地表、地下水及饮用水中已被发现有大量的人为来源加上自然来源的砷[4]，造成严重的水体砷污染。此外，如果水体遭受砷污染，可能导致微藻从养殖环境中积累大量砷，威胁保健品安全。
螺旋藻是地球上最古老的光合生物之一，它是一种单细胞丝状蓝藻，长约200~500μm[5.6]。螺旋藻目前已成为开发和利用价值最大的经济微藻之一[7],已被推荐为或者规定为一种安全型、营养型、保健型的全能保健食品。在2012年国家食品药品监督管理局以螺旋藻为原料保健食品展开的铅、砷、汞重金属专项监测中，有结果显示产品中铅、砷超过国家保健食品铅和总砷限量标准[8]。
国内外已有不少学者研究不同藻类对砷的吸收转化特性或抗性。许多研究表明，不同的藻类在不同形态、不同浓度的砷胁迫下会产生不同的代谢机制[34,9]。此外，作为水体的初级生产者，藻类能对砷高效累积并提升其向食物链的转移[10]，当藻体积累的砷超过国家标准限量（1.0 mgkg1）[8]时，可能对人体健康产生威胁。
目前国内外对螺旋藻研究主要集中在Cd、Cr、Pb、Cu等多种高浓度重金元素抑制螺旋藻的生长，并在藻体内富集[1115]。有关螺旋藻对砷的吸收和代谢的研究仍鲜有报道。因此，本课题通过不同形态和浓度的砷处理螺旋藻，研究螺旋藻对砷的吸收、转化特性，以期为螺旋藻砷污染的控制提供依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
试验藻种为钝顶螺旋藻（Spirulina platensis）购自山东青岛中国科学院海洋生物种质库，采用Zarrouk培养液培养（pH调节至9.0，121 ℃高压蒸汽灭菌30 min）[16]，光照强度为3500~4000 lux，光照明暗比 12h:12h，培养期间每天定时摇匀3次。
1.2 试验设计
将生长至对数期的螺旋藻接种于1 L锥形瓶中，接种初始OD560nm约为0.2。之后分别取200 mL藻液于500 mL锥形瓶中，加入浓度为50、100、200、300 μgL1的 As(Ⅲ)（以NaAsO2进行配制）或As(Ⅴ)母液（以Na3AsO412H2O配制）进行处理。每个处理设置3个平行，并以不加砷的藻液作为空白对照。处理7 d后用快速滤纸过滤收获藻体，用0.1 molL1 PBS（pH=7.0）清洗（每次5 mL冲洗3次），去除藻细胞表面吸附的砷[17]，再经冷冻干燥后测定藻内吸收的砷含量及其形态.本研究预实验结果表明，PBS不会对藻细胞的完整性产生影响。
1.2.1 生物量测定 螺旋藻经As(Ⅲ)和As(Ⅴ)处理7 d后，用快速滤纸过滤收集藻体，并冷冻干燥24 h。滤纸和藻体的质量与过滤前滤纸的质量之差即为螺旋藻的生物量。同时将未过滤藻液的滤纸同批次冷冻干燥，避免滤纸水分造成的误差。
1.2.2 藻体吸收的总砷含量测定 将冷冻干燥后的螺旋藻样磨碎，称量约0.05 g样品于25 mL玻璃消煮管中，加入2 mL 体积比为4:1的HNO3:HClO4混合酸，静置过夜[18]。采用Lab Tech ED54型智能样品消解仪（莱伯泰科有限公司）电热消解至溶液澄清透明，打开消煮管塞进行赶酸至消煮管内剩下0.2 mL左右液体时，取出消煮管静置冷却。用去离子水润洗移至10 mL容量瓶中，加0.5 mL浓盐酸（优级纯）和2 mL 5%硫脲+5%抗坏血酸混合溶液后定容。采用氢化物发生双道原子荧光光度计（HGAFS，北京吉天仪器有限公司）测定其总砷含量，以同批次藻样相同步骤加标消解进行加标回收，回收率为93.24%~107.27%。
1.2.3 砷形态提取及测定 准确称取0.05 g干样于10 mL离心管中，加入3 mL 0.28 molL1 HNO3进行提取，90 ℃超声10 min后14000 g离心10 min，重复提取3次[18]，上清液合并后定容至10 mL。定容后的样品用0.22 μm滤膜过滤，滤液过阴离子交换柱（Hamilton PRPX100），采用高效液相氢化物发生原子荧光（HPLCHGAFS，北京吉天仪器有限公司）测定螺旋藻中砷的形态。同时设置As(Ⅲ)、一甲基砷（MMA）、二甲基砷（DMA）、As(V)的加标回收实验，砷形态提取率为94.73%~134.23%。检测条件如下[19]：流动相为17.5 mmolL1磷酸氢二铵（pH=6.1），等度洗脱；进样体积100 μL；载流：5%盐酸；还原剂：1.5%硼氢化钾＋0.5%氢氧化钾；屏蔽气：700 mLmin1；载气：Ar，600 mLmin1；光电倍增管电压：270 V；灯电流：100 mA。
1.3 数据处理
运用Excel 2010和SPSS 20统计分析软件进行数据处理与分析，用Excel作图。采用单因素方差分析（Oneway ANOVA）和Tukey检验进行差异显著性分析（p<0.05）。
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