土壤微生物区系结构和功能对夏威夷火山地区不同海拔降雨量下磷元素循环和动态演变的影响
摘要:土壤微生物区系组成和结构对环境因素变化的响应是微生物生态学研究的一个重要方向。微生物群落的功能结构和物种组成的差异能够明显地表征环境的变化。微生物担任磷元素生物地球化学循环驱动者的角色，其磷循环相关功能基因的变化、区系结构和功能的变化直接影响磷元素的生物地球化学循环。我们通过一种基因芯片技术GeoChip，结合Illumina MiSeq 16s RNA高通量测序技术，分析由于不同海拔降雨量下土壤性质的差异而导致的功能基因的变化、微生物群落结构和功能的变化以及微生物之间相互作用的变化。分析结果表明，磷循环相关功能基因在降雨量1800mm条件下相对丰度明显降低，微生物功能结构和物种结构随着降雨量的增加表现出明显的聚落差异。降雨量、土壤酸碱度与功能基因、微生物物种的分布呈现相关性。分子生态网络构建的结果显示，随着降雨量的变化，无论是功能基因还是物种，都存在起主导作用的基因和特定的微生物种类，可能的机制是：即使微生物种类和功能发生变化，其彼此之间的相互作用的稳定存在对行使整个微生物群落功能至关重要。总体来说，降雨量和土壤酸碱度对微生物群落结构和功能产生较大的影响，而微生物群落对其响应反映了群落内部应对这些环境变化的机制。
目录
摘要1
Abstracts 1
Keywords1
1绪论2
1.1土壤磷元素研究概况2
1.2微生物磷代谢循环2
1.3微生物地理学分研究2
1.4微生物功能基因和群落结构的主要研究方法3
1.4.1基因芯片技术3
1.4.2高通量测序技术3
1.5研究目标、内容和技术路线4
1.5.1研究目标4
1.5.2研究内容4
1.5.3研究技术路线4
2材料与方法4
2.1研究区域概况4
2.2实验设计与取样5
2.2.1实验设计5
2.2.2实验样品采集5
2.3土壤理化性质测定5
2.4土壤样品的功能基因芯片分析和高通量测序5
2.4.1土壤DNA的提取5
2.4.2土壤DNA的纯化5
2.4.3基因芯
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
片杂交以及数据预处理6
2.4.4 Illimina测序以及数据预处理 6
2.5统计分析7
2.5.1误差分析和作图软件7
2.5.2多元统计方法7
2.6微生物功能基因和物种间相互关系网络构建方法8
3结果与分析9
3.1环境因子分析9
3.2磷循环功能基因分析11
3.3磷循环功能基因和环境因子之间的关系12
3.4微生物种类类群分析13
3.5微生物物种分布和环境因子之间的关系15
3.6磷循环相关基因网络构建及分析15
3.7物种网络构建及分析17
3.8结论18
4讨论19
4.1环境因子之间的相互作用19
4.2磷循环功能基因的地理学分布19
4.3微生物地理学分布和磷循环功能基因分布的相互关系19
4.4微生物之间相互关系网络的优劣19
致谢20
附件一21
附件二22
附件三23
附件四24
附件五25
参考文献26 土壤微生物区系结构和功能对夏威夷火山地区不同海拔降雨量下磷元素循环和动态演变的影响
农业资源与环境 赵建树
引言
1.绪论
1.1土壤中磷元素研究概况
磷元素在土壤中主要以无机和有机两种形式存在，关于磷元素在土壤中的测量和分级，此前已经有研究者做过十分仔细的分析[1]，有机磷和无机磷在土壤中的转化和循环主要依靠微生物的作用，而关于微生物在土壤中磷循环发挥的作用，以及相关基因在循环中的具体变化，还没有过相关的研究。
1.2 微生物磷代谢循环
磷元素是构成生物体的基本元素之一，是脱氧核糖核酸、三磷酸腺苷和磷脂的重要组成成分。生物通过生物地球化学循环，从自然环境中富集磷元素，维持生命的生存和繁衍。而土壤则是生物地球化学循环发生的主要场所。作为土壤最重要的“栖息者”，微生物在磷元素生物地球化学循环中发挥了不可替代的作用。由于分子技术的进步，微生物代谢循环相关的基因机理研究越来越深入，越来越多的基因功能被认识，这也给我们这项研究带来可能。
微生物中和磷元素生物化学循环相关的基因主要包括GeoChip 5.0中检测到的几个: ppx，ppk，5f1_ppk，phytase，5f1_ppD。ppx是编码外切多聚磷酸酶(ExoPolyphosphatase)的基因，控制水解多聚磷酸酶；ppk是编码多聚磷酸盐激酶(PolyPhosphatase Kinase)的基因，主导多聚磷酸盐的合成；phytase是编码植酸酶的基因，用于微生物体内植酸的合成；其他几个属于ppk家族中的。Pit和Pst基因是磷酸盐转运系统中相关的基因，在组成水平上表达，本实验中没有涉及到相关的转运蛋白合成基因。在微生物体内，除了核酸和磷脂的形式，磷元素在微生物细胞内主要以多聚磷酸盐的方式储存，多聚磷酸盐(PolyPhosphate)是评价微生物贮藏磷元素的一个重要指标[2]。
1.3 微生物地理学研究
微生物地理学是研究生物群落的一种方法，如何定义微生物种是进行微生物生物地理学研究首先要考虑的问题。和大型物种的微生物地理学分布不同，微生物地理学在不同的尺度上分布受到的影响因素不同，在较大尺度上，微生物的分布仍然受到地理距离的影响，而在较小的尺度上，主要受到环境因素的影响[3]。由于微生物不具备生殖隔离的特征，且因个体小，难以培养，很难利用个体形态和生理特征进行物种鉴定，物种的定义对微生物地理学得研究非常重要，目前主要利用16s RNA基因的可操作分类单元表征微生物物种水平的分类单元（Operational Taxonomic Unit）。通常将相似度97%以上的16s RNA基因划分为同一物种。
微生物群落组成和多样性是微生物地理学关注的重点，可以通过对微生物群落和多样性的研究，深入了解群落结构，功能组成，从微观的角度理解生态环境对微生物分布的影响。研究微生物群落组成的方法和描述性指标有很多，可以根据微生物的分类信息进行归纳，用α多样性表征群落内部的多样性，包括丰富度，均匀度等，β多样性可以表征群落之间的差异，包括BrayCurtis距离等[4]，基于微生物进化关系的Unifrac距离可以表征进化上的距离[5]。
总体上来说，影响微生物地理分布格局、多样性以及群落特征的因素主要有以下四个因素：(1)微生物的扩散，扩散取决于整个微生物群体的扩散能力，直接决定在空间上的分布格局。（2）自然选择，在生物因素和非生物因素的共同选择条件下，微生物在繁殖的过程中产生差异，改变了群落结构。（3）漂移，一些随机事件的发生导致了整个微生物群落的改变。（4）物种形成和灭绝的速率，物种进化和灭绝的速率决定了特定种群内部微生物的数量[6]。
此前，关于微生物功能基因沿地理位置分布的研究不多，物种沿海拔和地理距离分布的研究较多，Chu等研究发现，在长白山的不同海拔的土壤中，微生物物种的分布受到pH的影响最大，而且酸杆菌门与pH的变化成明显的正相关关系[7]。由于存在微生物间基因的水平转移，微生物物种的变化并不能反映功能的变化，因此功能的研究和分布可以从一个不同的角度揭示不同生态环境条件下，土壤性能的变化。功能基因水平上的分布的差异，更能够表征土壤功能的差异，比如硝化潜力、呼吸量等。
1.4 微生物功能基因和群落结构的主要研究方法
目录
摘要1
Abstracts 1
Keywords1
1绪论2
1.1土壤磷元素研究概况2
1.2微生物磷代谢循环2
1.3微生物地理学分研究2
1.4微生物功能基因和群落结构的主要研究方法3
1.4.1基因芯片技术3
1.4.2高通量测序技术3
1.5研究目标、内容和技术路线4
1.5.1研究目标4
1.5.2研究内容4
1.5.3研究技术路线4
2材料与方法4
2.1研究区域概况4
2.2实验设计与取样5
2.2.1实验设计5
2.2.2实验样品采集5
2.3土壤理化性质测定5
2.4土壤样品的功能基因芯片分析和高通量测序5
2.4.1土壤DNA的提取5
2.4.2土壤DNA的纯化5
2.4.3基因芯
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
片杂交以及数据预处理6
2.4.4 Illimina测序以及数据预处理 6
2.5统计分析7
2.5.1误差分析和作图软件7
2.5.2多元统计方法7
2.6微生物功能基因和物种间相互关系网络构建方法8
3结果与分析9
3.1环境因子分析9
3.2磷循环功能基因分析11
3.3磷循环功能基因和环境因子之间的关系12
3.4微生物种类类群分析13
3.5微生物物种分布和环境因子之间的关系15
3.6磷循环相关基因网络构建及分析15
3.7物种网络构建及分析17
3.8结论18
4讨论19
4.1环境因子之间的相互作用19
4.2磷循环功能基因的地理学分布19
4.3微生物地理学分布和磷循环功能基因分布的相互关系19
4.4微生物之间相互关系网络的优劣19
致谢20
附件一21
附件二22
附件三23
附件四24
附件五25
参考文献26 土壤微生物区系结构和功能对夏威夷火山地区不同海拔降雨量下磷元素循环和动态演变的影响
农业资源与环境 赵建树
引言
1.绪论
1.1土壤中磷元素研究概况
磷元素在土壤中主要以无机和有机两种形式存在，关于磷元素在土壤中的测量和分级，此前已经有研究者做过十分仔细的分析[1]，有机磷和无机磷在土壤中的转化和循环主要依靠微生物的作用，而关于微生物在土壤中磷循环发挥的作用，以及相关基因在循环中的具体变化，还没有过相关的研究。
1.2 微生物磷代谢循环
磷元素是构成生物体的基本元素之一，是脱氧核糖核酸、三磷酸腺苷和磷脂的重要组成成分。生物通过生物地球化学循环，从自然环境中富集磷元素，维持生命的生存和繁衍。而土壤则是生物地球化学循环发生的主要场所。作为土壤最重要的“栖息者”，微生物在磷元素生物地球化学循环中发挥了不可替代的作用。由于分子技术的进步，微生物代谢循环相关的基因机理研究越来越深入，越来越多的基因功能被认识，这也给我们这项研究带来可能。
微生物中和磷元素生物化学循环相关的基因主要包括GeoChip 5.0中检测到的几个: ppx，ppk，5f1_ppk，phytase，5f1_ppD。ppx是编码外切多聚磷酸酶(ExoPolyphosphatase)的基因，控制水解多聚磷酸酶；ppk是编码多聚磷酸盐激酶(PolyPhosphatase Kinase)的基因，主导多聚磷酸盐的合成；phytase是编码植酸酶的基因，用于微生物体内植酸的合成；其他几个属于ppk家族中的。Pit和Pst基因是磷酸盐转运系统中相关的基因，在组成水平上表达，本实验中没有涉及到相关的转运蛋白合成基因。在微生物体内，除了核酸和磷脂的形式，磷元素在微生物细胞内主要以多聚磷酸盐的方式储存，多聚磷酸盐(PolyPhosphate)是评价微生物贮藏磷元素的一个重要指标[2]。
1.3 微生物地理学研究
微生物地理学是研究生物群落的一种方法，如何定义微生物种是进行微生物生物地理学研究首先要考虑的问题。和大型物种的微生物地理学分布不同，微生物地理学在不同的尺度上分布受到的影响因素不同，在较大尺度上，微生物的分布仍然受到地理距离的影响，而在较小的尺度上，主要受到环境因素的影响[3]。由于微生物不具备生殖隔离的特征，且因个体小，难以培养，很难利用个体形态和生理特征进行物种鉴定，物种的定义对微生物地理学得研究非常重要，目前主要利用16s RNA基因的可操作分类单元表征微生物物种水平的分类单元（Operational Taxonomic Unit）。通常将相似度97%以上的16s RNA基因划分为同一物种。
微生物群落组成和多样性是微生物地理学关注的重点，可以通过对微生物群落和多样性的研究，深入了解群落结构，功能组成，从微观的角度理解生态环境对微生物分布的影响。研究微生物群落组成的方法和描述性指标有很多，可以根据微生物的分类信息进行归纳，用α多样性表征群落内部的多样性，包括丰富度，均匀度等，β多样性可以表征群落之间的差异，包括BrayCurtis距离等[4]，基于微生物进化关系的Unifrac距离可以表征进化上的距离[5]。
总体上来说，影响微生物地理分布格局、多样性以及群落特征的因素主要有以下四个因素：(1)微生物的扩散，扩散取决于整个微生物群体的扩散能力，直接决定在空间上的分布格局。（2）自然选择，在生物因素和非生物因素的共同选择条件下，微生物在繁殖的过程中产生差异，改变了群落结构。（3）漂移，一些随机事件的发生导致了整个微生物群落的改变。（4）物种形成和灭绝的速率，物种进化和灭绝的速率决定了特定种群内部微生物的数量[6]。
此前，关于微生物功能基因沿地理位置分布的研究不多，物种沿海拔和地理距离分布的研究较多，Chu等研究发现，在长白山的不同海拔的土壤中，微生物物种的分布受到pH的影响最大，而且酸杆菌门与pH的变化成明显的正相关关系[7]。由于存在微生物间基因的水平转移，微生物物种的变化并不能反映功能的变化，因此功能的研究和分布可以从一个不同的角度揭示不同生态环境条件下，土壤性能的变化。功能基因水平上的分布的差异，更能够表征土壤功能的差异，比如硝化潜力、呼吸量等。
1.4 微生物功能基因和群落结构的主要研究方法
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