乙酰辅酶a合成酶对于中链脂肪酸合成的影响
逆向脂肪酸β-氧化途径是合成中链脂肪酸最有效的途径。作为此途径的必须前体乙酰辅酶A却缺乏高效的合成途径。目前，合成乙酰辅酶A 的途径主要以敲除基因为主，但此途径不够高效。为此研究如何高效合成乙酰辅酶A并将其应用于中链脂肪酸的合成具有重要的意义。本文将讨论以乙酸盐转化成为乙酰辅酶A的方法来高效合成乙酰辅酶A。即探讨如何通过构建乙酰辅酶A前体途径，高效的表达乙酰辅酶A 合成酶，生产乙酰辅酶A，在提高胞内乙酰辅酶A含量的同时降低有毒副产物乙酸的积累，不影响菌体生长，从而提高中链脂肪酸的产量。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法3
1.1 实验材料 3
1.2 试验方法 3
1.2.1 基因的克隆3
1.2.2 目的基因表达载体的构建5
1.2.3 基因工程菌发酵8
1.2.4 产物测定8
2 结果与分析9
2.1 合成乙酰辅酶A关键基因的获得9
2.2 目的基因表达载体的构建10
2.3 脂肪酸产量验证14
3 讨论17
3.1 研究意义18
3.2 未来研究规划18
致谢19
参考文献20
乙酰辅酶A合成酶对中链脂肪酸合成的影响
引言
2015年中国居民营养与慢性病状况报告显示，我国慢性病防控形势依然严峻[1]。我国超重率、肥胖率大幅增加，导致高血压患病、心脑血管疾病、糖尿病等慢性疾病的发病率也不断上升。引发肥胖的重要原因之一是人体饮食中摄入的脂肪过多，而普通食用油是以长链脂肪酸（碳链长度＞12）[2]为主要组成部分，在人体内易被再次合成为中性脂肪；与长链脂肪酸相比，中链脂肪酸（碳链长度6~12）[2]具有独特的消化吸收快、能量释放快、不以脂肪形式贮存等特性，不会造成人体肥胖的优点[34]。实践证明，食用中链脂肪酸的功能性油脂对人体的健康有积极作用，比如体重、腹部脂肪面积的减少、腰围的减少。另外研究表明，中链脂肪酸可以治疗人类各种疾病，例如肥胖、胰岛素抵抗[5]、心脑血管疾 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
病[68]，同时具有抗菌、抗病毒[9]、抗癌症[10]、促进维生素吸收和降低炎性细胞因子产生的作用[1112]。综上所述，功能性油脂中链脂肪酸可广泛应用于食品、药品等领域[13]，具有十分重要的意义。
然而目前中链脂肪酸的来源主要是椰子油和棕榈仁油，均是热带树木产物，难以广泛栽培，并且中链脂肪酸的含量较少。另外植物提取法在原料来源和产量上受季节性因素影响较大，而且存在多种结构类似物，高纯度产品的提取成本较高，这些都严重限制了中链脂肪酸的广泛应用。目前，中链脂肪酸生产主要以动植物油脂为原料进行生产，但这些油脂受季节、地域等因素限制，生产成本高，不利于大规模工业化生产应用[14]。而且大部分动植物油脂是以长链脂肪酸为主要成分，中链脂肪酸的含量相对较低。与低效、高成本的植物提取法相比，微生物法生产因其具有的绿色、高效、低成本、可连续化生产等优势而受到研究者们的广泛关注。随着分子生物学技术的发展，通过代谢工程手段对微生物细胞进行定向调控，发酵生产获得优质的中链脂肪酸，具有十分重要的研究价值[15]。
大肠杆菌作为一种模式微生物，能够模拟其他微生物的代谢过程，异源表达来自不同物种的基因，是研究微生物转化并应用于实际生产的重要菌株[16]。另外，大肠杆菌是人们克隆表达外源基因的主要菌株，因为其有大量可供选择的克隆载体与表达载体，同时其基因组已被完全测序和脂肪酸代谢已被充分研究；在遗传学方面，大肠杆菌是脂肪酸生产的优良宿主。尽管在脂肪酸的脂质和细胞膜生物合成的内在能力方面，大肠杆菌通常不积累游离脂肪酸作为中间体。脂肪酸代谢在转录和转录后受到转录因子和产物抑制的严格调节，这意味着脂肪酸过量产生可能需要细胞代谢的显着重建。大肠杆菌K12系列菌株已经被定义为GRAS (Generally Recognized As Safe) ，用于生产食品添加剂如凝乳酶[17]，因此大肠杆菌也可以用于生产食用油脂。综上所述，大肠杆菌是生产脂肪酸的最合适菌株[18]。
目前合成脂肪酸主要有脂肪酸合成途径、酮酸途径和逆向脂肪酸β氧化途径。这三个途径中逆向脂肪酸β氧化途径具有最高的合成效率[19]。在大肠杆菌中，在需氧条件下的乙酰辅酶A代谢将导致乙酸盐形成，其是有毒的副产物并且可以抑制细胞生长。在大肠杆菌中，乙酸盐通过两种不同的途径，经过自然循环，以形成乙酰辅酶A。第一途径通过两种酶（AckA和Pta）互相转化乙酸盐和乙酰辅酶A。第二个途径通过乙酰辅酶A合成酶的作用吸收乙酸盐。乙酰辅酶A合成酶A1（ACSS1）和乙酰辅酶A合成酶A2（ACSS2）编码乙酰辅酶A1和乙酰辅酶A2。乙酰辅酶A合成酶（ACSS）能够将乙酸与辅酶A 连接合成乙酰辅酶A 为脂肪酸合成提供原料[20]。因此本文的思路即为通过乙酰辅酶A合成酶的作用增加乙酸同化途径的表达，乙酰辅酶A合成酶将乙酸回收回乙酰辅酶A，同时减少发酵液中的乙酸盐积累，减少菌体的损伤提高中链脂肪酸产量。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 原料
大肠杆菌K12系列菌株。
1．1．2 培养基
1．1．2．1 LB液体培养基（以1000mL为例）
表1 LB液体培养基（以1000mL为例）
试剂
质量（g）
生产商
胰蛋白胨（Tryptone）
10
英国OXOID公司
酵母浸出粉（Yeast extract）
5
英国OXOID公司
NaCl
10
西陇科学股份有限公司
1．1．2．2 发酵培养基（以1000mL为例）
表2 发酵培养基（以1000mL为例）
试剂
质量（g）
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法3
1.1 实验材料 3
1.2 试验方法 3
1.2.1 基因的克隆3
1.2.2 目的基因表达载体的构建5
1.2.3 基因工程菌发酵8
1.2.4 产物测定8
2 结果与分析9
2.1 合成乙酰辅酶A关键基因的获得9
2.2 目的基因表达载体的构建10
2.3 脂肪酸产量验证14
3 讨论17
3.1 研究意义18
3.2 未来研究规划18
致谢19
参考文献20
乙酰辅酶A合成酶对中链脂肪酸合成的影响
引言
2015年中国居民营养与慢性病状况报告显示，我国慢性病防控形势依然严峻[1]。我国超重率、肥胖率大幅增加，导致高血压患病、心脑血管疾病、糖尿病等慢性疾病的发病率也不断上升。引发肥胖的重要原因之一是人体饮食中摄入的脂肪过多，而普通食用油是以长链脂肪酸（碳链长度＞12）[2]为主要组成部分，在人体内易被再次合成为中性脂肪；与长链脂肪酸相比，中链脂肪酸（碳链长度6~12）[2]具有独特的消化吸收快、能量释放快、不以脂肪形式贮存等特性，不会造成人体肥胖的优点[34]。实践证明，食用中链脂肪酸的功能性油脂对人体的健康有积极作用，比如体重、腹部脂肪面积的减少、腰围的减少。另外研究表明，中链脂肪酸可以治疗人类各种疾病，例如肥胖、胰岛素抵抗[5]、心脑血管疾 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
病[68]，同时具有抗菌、抗病毒[9]、抗癌症[10]、促进维生素吸收和降低炎性细胞因子产生的作用[1112]。综上所述，功能性油脂中链脂肪酸可广泛应用于食品、药品等领域[13]，具有十分重要的意义。
然而目前中链脂肪酸的来源主要是椰子油和棕榈仁油，均是热带树木产物，难以广泛栽培，并且中链脂肪酸的含量较少。另外植物提取法在原料来源和产量上受季节性因素影响较大，而且存在多种结构类似物，高纯度产品的提取成本较高，这些都严重限制了中链脂肪酸的广泛应用。目前，中链脂肪酸生产主要以动植物油脂为原料进行生产，但这些油脂受季节、地域等因素限制，生产成本高，不利于大规模工业化生产应用[14]。而且大部分动植物油脂是以长链脂肪酸为主要成分，中链脂肪酸的含量相对较低。与低效、高成本的植物提取法相比，微生物法生产因其具有的绿色、高效、低成本、可连续化生产等优势而受到研究者们的广泛关注。随着分子生物学技术的发展，通过代谢工程手段对微生物细胞进行定向调控，发酵生产获得优质的中链脂肪酸，具有十分重要的研究价值[15]。
大肠杆菌作为一种模式微生物，能够模拟其他微生物的代谢过程，异源表达来自不同物种的基因，是研究微生物转化并应用于实际生产的重要菌株[16]。另外，大肠杆菌是人们克隆表达外源基因的主要菌株，因为其有大量可供选择的克隆载体与表达载体，同时其基因组已被完全测序和脂肪酸代谢已被充分研究；在遗传学方面，大肠杆菌是脂肪酸生产的优良宿主。尽管在脂肪酸的脂质和细胞膜生物合成的内在能力方面，大肠杆菌通常不积累游离脂肪酸作为中间体。脂肪酸代谢在转录和转录后受到转录因子和产物抑制的严格调节，这意味着脂肪酸过量产生可能需要细胞代谢的显着重建。大肠杆菌K12系列菌株已经被定义为GRAS (Generally Recognized As Safe) ，用于生产食品添加剂如凝乳酶[17]，因此大肠杆菌也可以用于生产食用油脂。综上所述，大肠杆菌是生产脂肪酸的最合适菌株[18]。
目前合成脂肪酸主要有脂肪酸合成途径、酮酸途径和逆向脂肪酸β氧化途径。这三个途径中逆向脂肪酸β氧化途径具有最高的合成效率[19]。在大肠杆菌中，在需氧条件下的乙酰辅酶A代谢将导致乙酸盐形成，其是有毒的副产物并且可以抑制细胞生长。在大肠杆菌中，乙酸盐通过两种不同的途径，经过自然循环，以形成乙酰辅酶A。第一途径通过两种酶（AckA和Pta）互相转化乙酸盐和乙酰辅酶A。第二个途径通过乙酰辅酶A合成酶的作用吸收乙酸盐。乙酰辅酶A合成酶A1（ACSS1）和乙酰辅酶A合成酶A2（ACSS2）编码乙酰辅酶A1和乙酰辅酶A2。乙酰辅酶A合成酶（ACSS）能够将乙酸与辅酶A 连接合成乙酰辅酶A 为脂肪酸合成提供原料[20]。因此本文的思路即为通过乙酰辅酶A合成酶的作用增加乙酸同化途径的表达，乙酰辅酶A合成酶将乙酸回收回乙酰辅酶A，同时减少发酵液中的乙酸盐积累，减少菌体的损伤提高中链脂肪酸产量。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 原料
大肠杆菌K12系列菌株。
1．1．2 培养基
1．1．2．1 LB液体培养基（以1000mL为例）
表1 LB液体培养基（以1000mL为例）
试剂
质量（g）
生产商
胰蛋白胨（Tryptone）
10
英国OXOID公司
酵母浸出粉（Yeast extract）
5
英国OXOID公司
NaCl
10
西陇科学股份有限公司
1．1．2．2 发酵培养基（以1000mL为例）
表2 发酵培养基（以1000mL为例）
试剂
质量（g）
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