乌饭树叶黄酮超声-微波辅助碱提工艺及其抑菌活性2
乌饭树叶黄酮超声-微波辅助碱提工艺及其抑菌活性2[20200408174626]
摘 要
以宜兴乌饭树叶(Vaccinium bracteatum Thunb. Leaves, VBTL)为原料，以氢氧化钙作为提取试剂，利用超声-微波辅助技术对乌饭树叶黄酮进行提取，以乌饭树叶黄酮得率为指标，探讨微波功率、pH、提取时间和料液比对乌饭树叶黄酮得率的影响。在单因素实验的基础上，采用响应面分析法对超声-微波辅助碱提乌饭树叶黄酮最佳工艺条件进行优化。以抑菌直径和最小抑菌浓度为指标，采用管碟法、二倍稀释法探讨乌饭树叶碱提黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉和酿酒酵母的抑菌活性。结果表明超声-微波辅助碱提乌饭树叶黄酮最佳工艺条件为：微波功率66W、pH8.2、料液比1:35（g/mL）、时间10.5 min。与传统水浴浸提法相比，超声-微波协同萃取法缩短了139.5min的提取时间，减少了12.5%的提取剂用量。乌饭树叶碱提黄酮对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌和大肠杆菌等有一定的抑菌作用，其中对金黄色葡萄球菌最为明显，但对霉菌和酵母没有抑菌效果。乌饭树叶碱提黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度(MIC )分别为1.64mg/mL、0.82mg/mL和3.27mg/mL。
*查看完整论文请 +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:乌饭树叶黄酮超声-微波协同萃取响应面分析抑菌
目 录
1. 引言 1
2. 材料与方法 2
2.1 材料 2
2.2 仪器 2
2.3 实验方法 2
2.3.1 乌饭树叶黄酮的提取工艺 2
2.3.2 乌饭树叶黄酮标准曲线的绘制——AlCl3法 2
2.3.3 黄酮得率计算 3
2.3.4 超声-微波协同萃取碱提乌饭树叶黄酮的单因素实验 3
2.3.5 响应面法优化分析乌饭树叶碱提黄酮的提取工艺 3
2.3.6 超声-微波协同萃取法与传统水浴浸提法比较 4
2.3.7 抑菌作用研究 4
3. 结果与分析 6
3.1 标准曲线的绘制 6
3.2 单因素试验结果 6
3.2.1 提取时间对黄酮得率的影响 6
3.2.2 微波功率对黄酮得率的影响 6
3.2.3 料液比对黄酮得率的影响 7
3.2.4 pH对黄酮得率的影响 8
3.3 Box- Behnken中心设计及其响应面法优化乌饭树叶黄酮的提取工艺 8
3.3.1 响应面试验设计和结果 8
3.3.2 不同因素对乌饭树叶黄酮得率的影响分析 10
3.3.3 响应面图分析 11
3.3.4 响应面结果优化与验证实验 13
3.4 超声-微波协同萃取法与传统水浴浸提法最佳工艺的比较 14
3.4.1 传统水浴浸提法实验 14
3.4.2 超声-微波协同萃取法与传统水浴浸提法比较 15
3.5 乌饭树叶碱提黄酮抑菌试验结果 15
3.5.1 抑菌圈的确定 15
3.5.2 最小抑菌浓度（MIC）的确定 16
4. 结论 17
参考文献 18
致谢 19
1. 引言
乌饭树(Vaccinium bracteatum Thunb.)，又称南烛、乌饭草等，杜鹃花科，越桔属，多为落叶或常绿灌木，主要生长在马尾松林内、丘陵地带和海拔400-1400 m的山坡灌木丛中，以及向阳山坡路旁，因在浙江、江苏、福建一带以其茎叶浸泡染色米，加工乌饭，故得名[1]。乌饭树在我国储量极其丰富，且作为中草药，蕴含丰富的花青苷、有机酸、黄酮、肌醇维生素等功能性成分[2]。现代医学研究表明，乌饭树叶黄酮除了能降低心肌耗氧量、软化血管、降低血糖等，也可以清除超氧离子自由基、延缓衰老、增强免疫力等，是一种天然的抗氧化剂[3]。因此， 乌饭树叶黄酮类成分提取工艺的研究对开发利用乌饭树叶具有重要意义。
用传统水浴法从乌饭树叶中提取黄酮的速度慢、提取率不高，而利用超声-微波协同提取法速度快、提取率高、环保，是近年被开发的新技术[4]。许多黄酮类化合物分子中有酚羟基，显酸性，所以可用氢氧化钙碱液提取，但为了避免强碱破坏其母核，碱液pH要适宜[5]。
此外，研究乌饭树叶碱提黄酮的抑菌活性大小，为开发此类天然防腐剂提供了依据。在食品生产中，为保证食品质量，并延长食品货架期，常用高温处理达到灭菌。有些食物不适用高温杀菌，因此化学防腐剂更广泛地被应用在食品中，但化学防腐剂由于安全性，使用量受到限制。随着生活水平的普遍提高，绿色食品更加普及，人们越来越对化学防腐剂产生顾虑。而乌饭树叶作为天然防腐剂，其并未得到足够的重视和广泛地应用，如果能将乌饭树叶黄酮高效地提取并且添加在食品中，那不仅能成为具有中国传统特色的天然防腐剂，更将一直以来被浪费的乌饭树叶物尽其用，产生经济效益[6]。
2. 材料与方法
2.1 材料
乌饭树叶（采自无锡宜兴）；
槲皮素标准品、氢氧化钙、氯化钠、三氯化铝等均为分析纯；
金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉、酿酒酵母(菌种为微生物实验室提供)；
牛肉膏蛋白胨培养基、PDA培养基、YPD培养基。
2.2 仪器
超声-微波协同萃取仪（CW-2000 中国·上海新拓分析仪器科技有限公司）
精密天平（PGC-753e 艾德姆衡器）
数显恒温水浴锅（HH-2 金坛市杰瑞尔电器有限公司）
1000克摇摆式高速中药粉碎机（HK-20B 广州市旭朗机械设备有限公司）
可见分光光度计（722型 上海菁华科技仪器有限公司）
旋转蒸发器（RE-52A 上海亚荣生化仪器厂）
循环水式多用真空泵（SHB-B95型 郑州长城科工贸有限公司）
立式压力蒸汽灭菌锅（LDZX-75KBS 上海申安医疗器械厂）
不锈钢胆电热恒温培养箱（DHP-90 上海索普机械有限公司）
2.3 实验方法
2.3.1 乌饭树叶黄酮的提取工艺
乌饭树叶干燥→粉碎机粉碎→过40目筛→碱液→超声-微波协同萃取仪提取→抽滤→除渣→待测液备用
2.3.2 乌饭树叶黄酮标准曲线的绘制——AlCl3法[7]
以槲皮素作为标准品做定量分析。精确称取槲皮素5mg置于100ml容量瓶中，用95%乙醇定容后得到浓度为50 mg/L的标准液。分别移取0、0.4、0.8、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2 ml 50 mg/L标准液至10ml容量瓶中，用1%AlCl3定容，摇匀，分别在434nm处测定吸光度，以吸光度(OD)为纵坐标、浓度(C)为横坐标绘制标准曲线。
2.3.3 黄酮得率计算[8]
准确称取1g乌饭树叶粉末，按照一定的料液比加入氢氧化钙，调节不同pH的碱液，抽滤后得到的待测液用蒸馏水定容至100mL容量瓶后，从中吸取2mL于10mL容量瓶，用1% AlCl3定容，测量吸光度。平行测定三次取平均值为Y，代入标准曲线查出相应的黄酮浓度为X (mg/L)。则黄酮得率按照以下公式计算：
黄酮得率（mg/g）=(X * 10 *100) / (1000 * 2 ) （1）
式中：X(mg/L)—用标准曲线查出相应的黄酮浓度。
2.3.4 超声-微波协同萃取碱提乌饭树叶黄酮的单因素实验
（1）提取时间对乌饭树叶黄酮得率的影响
分别精确称取1g乌饭树叶粉末，用氢氧化钙溶液（pH为9）进行提取，设定微波功率为60W，料液比为1：30(g/mL)的条件下，提取时间分别为5 min、10 min、15 min、20 min、25 min，探讨提取时间对乌饭树叶黄酮得率的影响。
（2）微波功率对乌饭树叶黄酮得率的影响
分别精确称取1g乌饭树叶粉末，用氢氧化钙溶液（pH为9）进行提取，设定超声-微波提取时间为10 min，料液比为1：30(g/mL)的条件下，微波功率分别为30W、40W、50W、60W、70W，探讨微波功率对乌饭树叶黄酮得率的影响。
（3） 料液比对乌饭树叶黄酮得率的影响
摘 要
以宜兴乌饭树叶(Vaccinium bracteatum Thunb. Leaves, VBTL)为原料，以氢氧化钙作为提取试剂，利用超声-微波辅助技术对乌饭树叶黄酮进行提取，以乌饭树叶黄酮得率为指标，探讨微波功率、pH、提取时间和料液比对乌饭树叶黄酮得率的影响。在单因素实验的基础上，采用响应面分析法对超声-微波辅助碱提乌饭树叶黄酮最佳工艺条件进行优化。以抑菌直径和最小抑菌浓度为指标，采用管碟法、二倍稀释法探讨乌饭树叶碱提黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉和酿酒酵母的抑菌活性。结果表明超声-微波辅助碱提乌饭树叶黄酮最佳工艺条件为：微波功率66W、pH8.2、料液比1:35（g/mL）、时间10.5 min。与传统水浴浸提法相比，超声-微波协同萃取法缩短了139.5min的提取时间，减少了12.5%的提取剂用量。乌饭树叶碱提黄酮对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌和大肠杆菌等有一定的抑菌作用，其中对金黄色葡萄球菌最为明显，但对霉菌和酵母没有抑菌效果。乌饭树叶碱提黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度(MIC )分别为1.64mg/mL、0.82mg/mL和3.27mg/mL。
*查看完整论文请 +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:乌饭树叶黄酮超声-微波协同萃取响应面分析抑菌
目 录
1. 引言 1
2. 材料与方法 2
2.1 材料 2
2.2 仪器 2
2.3 实验方法 2
2.3.1 乌饭树叶黄酮的提取工艺 2
2.3.2 乌饭树叶黄酮标准曲线的绘制——AlCl3法 2
2.3.3 黄酮得率计算 3
2.3.4 超声-微波协同萃取碱提乌饭树叶黄酮的单因素实验 3
2.3.5 响应面法优化分析乌饭树叶碱提黄酮的提取工艺 3
2.3.6 超声-微波协同萃取法与传统水浴浸提法比较 4
2.3.7 抑菌作用研究 4
3. 结果与分析 6
3.1 标准曲线的绘制 6
3.2 单因素试验结果 6
3.2.1 提取时间对黄酮得率的影响 6
3.2.2 微波功率对黄酮得率的影响 6
3.2.3 料液比对黄酮得率的影响 7
3.2.4 pH对黄酮得率的影响 8
3.3 Box- Behnken中心设计及其响应面法优化乌饭树叶黄酮的提取工艺 8
3.3.1 响应面试验设计和结果 8
3.3.2 不同因素对乌饭树叶黄酮得率的影响分析 10
3.3.3 响应面图分析 11
3.3.4 响应面结果优化与验证实验 13
3.4 超声-微波协同萃取法与传统水浴浸提法最佳工艺的比较 14
3.4.1 传统水浴浸提法实验 14
3.4.2 超声-微波协同萃取法与传统水浴浸提法比较 15
3.5 乌饭树叶碱提黄酮抑菌试验结果 15
3.5.1 抑菌圈的确定 15
3.5.2 最小抑菌浓度（MIC）的确定 16
4. 结论 17
参考文献 18
致谢 19
1. 引言
乌饭树(Vaccinium bracteatum Thunb.)，又称南烛、乌饭草等，杜鹃花科，越桔属，多为落叶或常绿灌木，主要生长在马尾松林内、丘陵地带和海拔400-1400 m的山坡灌木丛中，以及向阳山坡路旁，因在浙江、江苏、福建一带以其茎叶浸泡染色米，加工乌饭，故得名[1]。乌饭树在我国储量极其丰富，且作为中草药，蕴含丰富的花青苷、有机酸、黄酮、肌醇维生素等功能性成分[2]。现代医学研究表明，乌饭树叶黄酮除了能降低心肌耗氧量、软化血管、降低血糖等，也可以清除超氧离子自由基、延缓衰老、增强免疫力等，是一种天然的抗氧化剂[3]。因此， 乌饭树叶黄酮类成分提取工艺的研究对开发利用乌饭树叶具有重要意义。
用传统水浴法从乌饭树叶中提取黄酮的速度慢、提取率不高，而利用超声-微波协同提取法速度快、提取率高、环保，是近年被开发的新技术[4]。许多黄酮类化合物分子中有酚羟基，显酸性，所以可用氢氧化钙碱液提取，但为了避免强碱破坏其母核，碱液pH要适宜[5]。
此外，研究乌饭树叶碱提黄酮的抑菌活性大小，为开发此类天然防腐剂提供了依据。在食品生产中，为保证食品质量，并延长食品货架期，常用高温处理达到灭菌。有些食物不适用高温杀菌，因此化学防腐剂更广泛地被应用在食品中，但化学防腐剂由于安全性，使用量受到限制。随着生活水平的普遍提高，绿色食品更加普及，人们越来越对化学防腐剂产生顾虑。而乌饭树叶作为天然防腐剂，其并未得到足够的重视和广泛地应用，如果能将乌饭树叶黄酮高效地提取并且添加在食品中，那不仅能成为具有中国传统特色的天然防腐剂，更将一直以来被浪费的乌饭树叶物尽其用，产生经济效益[6]。
2. 材料与方法
2.1 材料
乌饭树叶（采自无锡宜兴）；
槲皮素标准品、氢氧化钙、氯化钠、三氯化铝等均为分析纯；
金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉、酿酒酵母(菌种为微生物实验室提供)；
牛肉膏蛋白胨培养基、PDA培养基、YPD培养基。
2.2 仪器
超声-微波协同萃取仪（CW-2000 中国·上海新拓分析仪器科技有限公司）
精密天平（PGC-753e 艾德姆衡器）
数显恒温水浴锅（HH-2 金坛市杰瑞尔电器有限公司）
1000克摇摆式高速中药粉碎机（HK-20B 广州市旭朗机械设备有限公司）
可见分光光度计（722型 上海菁华科技仪器有限公司）
旋转蒸发器（RE-52A 上海亚荣生化仪器厂）
循环水式多用真空泵（SHB-B95型 郑州长城科工贸有限公司）
立式压力蒸汽灭菌锅（LDZX-75KBS 上海申安医疗器械厂）
不锈钢胆电热恒温培养箱（DHP-90 上海索普机械有限公司）
2.3 实验方法
2.3.1 乌饭树叶黄酮的提取工艺
乌饭树叶干燥→粉碎机粉碎→过40目筛→碱液→超声-微波协同萃取仪提取→抽滤→除渣→待测液备用
2.3.2 乌饭树叶黄酮标准曲线的绘制——AlCl3法[7]
以槲皮素作为标准品做定量分析。精确称取槲皮素5mg置于100ml容量瓶中，用95%乙醇定容后得到浓度为50 mg/L的标准液。分别移取0、0.4、0.8、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2 ml 50 mg/L标准液至10ml容量瓶中，用1%AlCl3定容，摇匀，分别在434nm处测定吸光度，以吸光度(OD)为纵坐标、浓度(C)为横坐标绘制标准曲线。
2.3.3 黄酮得率计算[8]
准确称取1g乌饭树叶粉末，按照一定的料液比加入氢氧化钙，调节不同pH的碱液，抽滤后得到的待测液用蒸馏水定容至100mL容量瓶后，从中吸取2mL于10mL容量瓶，用1% AlCl3定容，测量吸光度。平行测定三次取平均值为Y，代入标准曲线查出相应的黄酮浓度为X (mg/L)。则黄酮得率按照以下公式计算：
黄酮得率（mg/g）=(X * 10 *100) / (1000 * 2 ) （1）
式中：X(mg/L)—用标准曲线查出相应的黄酮浓度。
2.3.4 超声-微波协同萃取碱提乌饭树叶黄酮的单因素实验
（1）提取时间对乌饭树叶黄酮得率的影响
分别精确称取1g乌饭树叶粉末，用氢氧化钙溶液（pH为9）进行提取，设定微波功率为60W，料液比为1：30(g/mL)的条件下，提取时间分别为5 min、10 min、15 min、20 min、25 min，探讨提取时间对乌饭树叶黄酮得率的影响。
（2）微波功率对乌饭树叶黄酮得率的影响
分别精确称取1g乌饭树叶粉末，用氢氧化钙溶液（pH为9）进行提取，设定超声-微波提取时间为10 min，料液比为1：30(g/mL)的条件下，微波功率分别为30W、40W、50W、60W、70W，探讨微波功率对乌饭树叶黄酮得率的影响。
（3） 料液比对乌饭树叶黄酮得率的影响
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