江瑶柱粗多糖的分离纯化及其结构分析
目 录
1 引言 1
1.1 江瑶柱的简介及其营养价值 1
1.2 多糖的简介 1
1.3 多糖的分离纯化方法 1
1.4 纯化后多糖的结构分析 2
1.5 本课题的研究目的与意义 3
2 实验原料、试剂及仪器 4
2.1 主要实验原料 4
2.2 主要实验试剂 4
2.3 主要实验仪器 4
3 实验方案 4
3.1 江瑶柱多糖分离纯化 4
3.2 江瑶柱多糖结构分析 6
4 实验结果与分析 10
4.1 DEAE-52纤维素层析柱洗脱曲线 10
4.2 纯化多糖样品的结构分析 11
结 论 19
致 谢 20
参 考 文 献 21
1 引言
1.1 江瑶柱的简介
栉江瑶俗称“大海红”、“海锨”，是一种大型贝类，属软体动物门、双壳纲、莺蛤目、江珧蛤科、曲江珧蛤属。栉江瑶在世界各温、热带海洋中都有分布，我国主要分布在东南沿海，山东、广东、福建等地，其资源丰富。栉江瑶的后闭壳肌极粗大，俗称“江瑶柱”，其肉质鲜美，江瑶柱除了口味特别的鲜美以外，其营养价值还非常的高，除了含有大量的蛋白质和维生素以外，还含有丰富的牛磺酸[1]。《本草纲目》云：江瑶气味甘辛平，可以消渴下气，利五脏，止小便。因此，江瑶柱是很好的滋补产品。
1.2 多糖的简介
多糖（polysaccharide,PS）又被称作多聚糖，是一种由醛糖和酮糖通过脱水形成糖苷键，并通过糖苷键线性或分枝连接成的链状聚合物，是一种天然的具有广泛生物活性的大分 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
子物质，它的分子量一般能达到数万甚至是数百万。它是自然界里面含量最丰富的生物性聚合物，几乎存在于所有的生物中。按照多糖来源的不同，可把它分为动物多糖、植物多糖、真菌多糖、细菌多糖和藻类地衣多糖这五大类[2]。近几十年来，随着研究人员对分子生物学及糖化学的深入研究，人们对多糖有了一定程度上的认识。实验已证明它们中许多具有抗肿瘤、抗衰老、抗感染、抗放射损伤、降血糖、降血脂、增加机体免疫功能等生物活性[3]，并且没有毒也无副作用。
多糖生物资源的开发利用和研究日益深入，使多糖充分发挥了生物活性功能并在功能食品和临床方面上得到了广泛应用，多糖凭借其与免疫调节系统、细胞间的识别、癌症诊疗的紧密关系引起了医药界和分子生物界的强烈关注。人类已知的可被从天然产物里分离出来的多糖类化合物已经有300多种[4]。
本实验中研究的江瑶柱多糖属于贝类多糖。贝类多糖可以分成三类：（1）海洋贝类多糖：如鲍鱼多糖、海扇多糖；（2）淡水贝类多糖：如螺蛳多糖、河蚌多糖；（3）陆生贝类多糖：如蜗牛多糖。贝类多糖的结构复杂的原因有二，首先组成多糖的单糖品种就非常多，其次如果只由一种单糖组成，要是它的连接方式不一样(有无支链)，多糖的结构和功能也会不同[5]。因此，贝类多糖也是个非常有研究价值的课题。
1.3 多糖的分离纯化方法
在动植物中通常会存在许多种不同类型的多糖，所以要获得均一的多糖就需要对多糖的混合物进行分离和纯化。根据多糖性质的不同，常用的分离方法有乙醇分步沉淀法、冻融分级法、膜分离法、色谱法等，一般来说2-3种方法结合起来使用的效果比较好。柱色谱法就是目前在多糖的分离纯化方面使用最多且效果较好的方法，可以比较精细的分离粗多糖。通常是先用阴离子交换柱层析分离粗多糖，把各个组分的溶液收集起来进行浓缩、透析、冷冻干燥后，重新溶在去离子水里面再通过凝胶柱来进行层析，这种方法不仅能用于多糖的分离，还能用来检验多糖的纯度[6]。实验中分离多糖的时候，通常将粗多糖先经过色谱柱洗脱，再按照不同的洗脱浓度收集洗脱出来的含有多糖的溶液，这样就能分离得到各个单一的多糖纯化组分[7]。
1.4 纯化后多糖的结构分析
1.4.1 纯度、分子量的分析方法
纯度、分子量的测定采用高效液相色谱法，色谱柱中装有固定相，一般都把液体作为流动相，实验操作时把样品溶液泵入色谱柱中，让溶液中各个成分在通过色谱柱时分离开来，各自进入到检测器中进行扫描检测，得到高效液相色谱图，通过图谱对检测物进行分析。高效液相色谱法具有高压、高速、高效、高灵敏度的优点，广泛应用在分离分析中。本实验主要通过此方法来判断多糖的纯化组分的纯度及不同种类多糖的不同的分子量。
1.4.2 总糖含量的分析方法
总糖含量的测定采用苯酚-硫酸法，其测定原理为总糖在浓硫酸的作用下先水解成单糖，然后迅速脱水后生成糖醛衍生物，加入苯酚静置反应后生成黄色或者橙黄色的产物。在一定浓度范围里面，反应液的吸光度值和总糖的含量可以建立成一个线性关系，然后用分光光度计测定吸光值就可以测处样品里总糖的含量[8]。
1.4.3 蛋白质含量的分析方法
蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法，这个方法可以迅速并且准确的测出蛋白质。染料和蛋白质结合后会引起染料最大吸光度的改变，而且染料与蛋白质的结合大约只要2 min *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
，生成物的颜色在1 h内是稳定不变的。这个方法由于染色简单迅速、干扰物质少、灵敏度高，现在已经广泛应用在蛋白质含量的测定中。
1.4.4 糖醛酸含量的分析方法
糖醛酸含量的测定采用硫酸-间羟联苯法。这个方法的原理是多糖经过水解已经生成多聚己糖醛酸后，和含有四硼酸钠的硫酸溶液在高温作用下发生缩合反应，生成物再和间羟联苯反应，产生紫红色的衍生物,这样可以测定这个衍生物的吸光度，并且在一定浓度范围里，这个衍生物的吸光度和糖醛酸的含量可以建立一个线性关系，最后通过比色法对糖醛酸的含量进行计算[9,10]。
1.4.5 硫酸基含量的分析方法
硫酸基含量的测定采用氯化钡-明胶比色法，硫酸基是判断多糖是否是酸性多糖的一个重要指标。氯化钡-明胶比色法是利用硫酸基能与氯化钡-明胶相结合生成硫酸钡，硫酸钡沉淀物在放置的过程里会使样品浑浊，吸光度减少，从而测得不同的样品中的硫酸基含量。
1.4.6 紫外光谱分析
紫外分光光度法是是通过不同被测物质、不同浓度在紫外-可见光区的特定波长或一定波长范围内光的不同吸收光谱的曲线和吸光度对这些物质进行定性和定量分析的方法。本实验中主要用来确定多糖组分中是否含有核酸或者蛋白质。
1.4.7 红外光谱分析
红外光谱分析是对多糖结构进行初步研究的一种有效的方法，红外光谱的原理是通过检测物质大分子以及不同的原子或基团在不同波长区域内产生的振动从而得到红外谱图，根据图谱分析出物质的初步结构。红外光谱在多糖结构研究中可用于糖苷键及糖构型的确定、吡喃糖和呋喃糖的识别、单糖种类及糖链上主要取代基的鉴定[11]等方面的分析。本实验中主要用来分析纯化组分中是否存在多糖的特征吸收峰以及吡喃糖，同时初步分析糖构型。
1.5 本课题的研究目的与意义
仪器名称 仪器型号 生产厂家
电子天平 FA2004B 上海精科天美科学仪器有限公司
微量移液器 NPX-200 日本Nichipect EX公司
1 引言 1
1.1 江瑶柱的简介及其营养价值 1
1.2 多糖的简介 1
1.3 多糖的分离纯化方法 1
1.4 纯化后多糖的结构分析 2
1.5 本课题的研究目的与意义 3
2 实验原料、试剂及仪器 4
2.1 主要实验原料 4
2.2 主要实验试剂 4
2.3 主要实验仪器 4
3 实验方案 4
3.1 江瑶柱多糖分离纯化 4
3.2 江瑶柱多糖结构分析 6
4 实验结果与分析 10
4.1 DEAE-52纤维素层析柱洗脱曲线 10
4.2 纯化多糖样品的结构分析 11
结 论 19
致 谢 20
参 考 文 献 21
1 引言
1.1 江瑶柱的简介
栉江瑶俗称“大海红”、“海锨”，是一种大型贝类，属软体动物门、双壳纲、莺蛤目、江珧蛤科、曲江珧蛤属。栉江瑶在世界各温、热带海洋中都有分布，我国主要分布在东南沿海，山东、广东、福建等地，其资源丰富。栉江瑶的后闭壳肌极粗大，俗称“江瑶柱”，其肉质鲜美，江瑶柱除了口味特别的鲜美以外，其营养价值还非常的高，除了含有大量的蛋白质和维生素以外，还含有丰富的牛磺酸[1]。《本草纲目》云：江瑶气味甘辛平，可以消渴下气，利五脏，止小便。因此，江瑶柱是很好的滋补产品。
1.2 多糖的简介
多糖（polysaccharide,PS）又被称作多聚糖，是一种由醛糖和酮糖通过脱水形成糖苷键，并通过糖苷键线性或分枝连接成的链状聚合物，是一种天然的具有广泛生物活性的大分 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
子物质，它的分子量一般能达到数万甚至是数百万。它是自然界里面含量最丰富的生物性聚合物，几乎存在于所有的生物中。按照多糖来源的不同，可把它分为动物多糖、植物多糖、真菌多糖、细菌多糖和藻类地衣多糖这五大类[2]。近几十年来，随着研究人员对分子生物学及糖化学的深入研究，人们对多糖有了一定程度上的认识。实验已证明它们中许多具有抗肿瘤、抗衰老、抗感染、抗放射损伤、降血糖、降血脂、增加机体免疫功能等生物活性[3]，并且没有毒也无副作用。
多糖生物资源的开发利用和研究日益深入，使多糖充分发挥了生物活性功能并在功能食品和临床方面上得到了广泛应用，多糖凭借其与免疫调节系统、细胞间的识别、癌症诊疗的紧密关系引起了医药界和分子生物界的强烈关注。人类已知的可被从天然产物里分离出来的多糖类化合物已经有300多种[4]。
本实验中研究的江瑶柱多糖属于贝类多糖。贝类多糖可以分成三类：（1）海洋贝类多糖：如鲍鱼多糖、海扇多糖；（2）淡水贝类多糖：如螺蛳多糖、河蚌多糖；（3）陆生贝类多糖：如蜗牛多糖。贝类多糖的结构复杂的原因有二，首先组成多糖的单糖品种就非常多，其次如果只由一种单糖组成，要是它的连接方式不一样(有无支链)，多糖的结构和功能也会不同[5]。因此，贝类多糖也是个非常有研究价值的课题。
1.3 多糖的分离纯化方法
在动植物中通常会存在许多种不同类型的多糖，所以要获得均一的多糖就需要对多糖的混合物进行分离和纯化。根据多糖性质的不同，常用的分离方法有乙醇分步沉淀法、冻融分级法、膜分离法、色谱法等，一般来说2-3种方法结合起来使用的效果比较好。柱色谱法就是目前在多糖的分离纯化方面使用最多且效果较好的方法，可以比较精细的分离粗多糖。通常是先用阴离子交换柱层析分离粗多糖，把各个组分的溶液收集起来进行浓缩、透析、冷冻干燥后，重新溶在去离子水里面再通过凝胶柱来进行层析，这种方法不仅能用于多糖的分离，还能用来检验多糖的纯度[6]。实验中分离多糖的时候，通常将粗多糖先经过色谱柱洗脱，再按照不同的洗脱浓度收集洗脱出来的含有多糖的溶液，这样就能分离得到各个单一的多糖纯化组分[7]。
1.4 纯化后多糖的结构分析
1.4.1 纯度、分子量的分析方法
纯度、分子量的测定采用高效液相色谱法，色谱柱中装有固定相，一般都把液体作为流动相，实验操作时把样品溶液泵入色谱柱中，让溶液中各个成分在通过色谱柱时分离开来，各自进入到检测器中进行扫描检测，得到高效液相色谱图，通过图谱对检测物进行分析。高效液相色谱法具有高压、高速、高效、高灵敏度的优点，广泛应用在分离分析中。本实验主要通过此方法来判断多糖的纯化组分的纯度及不同种类多糖的不同的分子量。
1.4.2 总糖含量的分析方法
总糖含量的测定采用苯酚-硫酸法，其测定原理为总糖在浓硫酸的作用下先水解成单糖，然后迅速脱水后生成糖醛衍生物，加入苯酚静置反应后生成黄色或者橙黄色的产物。在一定浓度范围里面，反应液的吸光度值和总糖的含量可以建立成一个线性关系，然后用分光光度计测定吸光值就可以测处样品里总糖的含量[8]。
1.4.3 蛋白质含量的分析方法
蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法，这个方法可以迅速并且准确的测出蛋白质。染料和蛋白质结合后会引起染料最大吸光度的改变，而且染料与蛋白质的结合大约只要2 min *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
，生成物的颜色在1 h内是稳定不变的。这个方法由于染色简单迅速、干扰物质少、灵敏度高，现在已经广泛应用在蛋白质含量的测定中。
1.4.4 糖醛酸含量的分析方法
糖醛酸含量的测定采用硫酸-间羟联苯法。这个方法的原理是多糖经过水解已经生成多聚己糖醛酸后，和含有四硼酸钠的硫酸溶液在高温作用下发生缩合反应，生成物再和间羟联苯反应，产生紫红色的衍生物,这样可以测定这个衍生物的吸光度，并且在一定浓度范围里，这个衍生物的吸光度和糖醛酸的含量可以建立一个线性关系，最后通过比色法对糖醛酸的含量进行计算[9,10]。
1.4.5 硫酸基含量的分析方法
硫酸基含量的测定采用氯化钡-明胶比色法，硫酸基是判断多糖是否是酸性多糖的一个重要指标。氯化钡-明胶比色法是利用硫酸基能与氯化钡-明胶相结合生成硫酸钡，硫酸钡沉淀物在放置的过程里会使样品浑浊，吸光度减少，从而测得不同的样品中的硫酸基含量。
1.4.6 紫外光谱分析
紫外分光光度法是是通过不同被测物质、不同浓度在紫外-可见光区的特定波长或一定波长范围内光的不同吸收光谱的曲线和吸光度对这些物质进行定性和定量分析的方法。本实验中主要用来确定多糖组分中是否含有核酸或者蛋白质。
1.4.7 红外光谱分析
红外光谱分析是对多糖结构进行初步研究的一种有效的方法，红外光谱的原理是通过检测物质大分子以及不同的原子或基团在不同波长区域内产生的振动从而得到红外谱图，根据图谱分析出物质的初步结构。红外光谱在多糖结构研究中可用于糖苷键及糖构型的确定、吡喃糖和呋喃糖的识别、单糖种类及糖链上主要取代基的鉴定[11]等方面的分析。本实验中主要用来分析纯化组分中是否存在多糖的特征吸收峰以及吡喃糖，同时初步分析糖构型。
1.5 本课题的研究目的与意义
仪器名称 仪器型号 生产厂家
电子天平 FA2004B 上海精科天美科学仪器有限公司
微量移液器 NPX-200 日本Nichipect EX公司
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