前体和诱导子对桑悬浮细胞中次生物积累的影响(附件)【字数：14403】
摘 要摘 要桑树中的多种次生代谢产物，如黄酮、多糖和生物碱等，有降血糖、抗氧化、提高免疫力等作用，可以用作药物原料。植物细胞悬浮培养技术突破植物自身对于生长周期、地域和环境等因素的限制，可实现植物细胞代谢产物规模化生产的需求。本实验在成功建立桑悬浮细胞培养体系的前提下，研究了不同外源添加物（前体和诱导子）对桑悬浮细胞生长、黄酮含量、多糖含量以及1-DNJ含量积累的影响。实验结果表明各外源物对桑悬浮细胞生长都表现出一定的抑制效果，不利于悬浮细胞生物量的积累；但对其次生物积累表现出不同的诱导作用。MJ、SNP、COR和苯丙氨酸对悬浮细胞黄酮的积累均有促进作用，以MJ诱导效果最佳；对于多糖的积累，仅有COR表现出明显的促进效果；MJ对细胞系中1-DNJ诱导作用显著，而SNP对1-DNJ的积累有抑制作用。各外源添加物对桑悬浮细胞生长以及次生代谢物的合成表现出不同的诱导作用，不同的诱导子刺激植物细胞启动不同的防御反应，产生不同的次生代谢产物。关键词桑树；细胞悬浮培养；次生代谢产物；诱导子
目录
第一章 绪论 1
1.1 桑的概述 1
1.2 桑树中的活性成分 1
1.3 桑树悬浮细胞培养 2
1.3.1 悬浮细胞培养概述 2
1.3.2 植物悬浮细胞培养的影响因素 3
1.3.2.1 外植体 3
1.3.2.2 愈伤组织 3
1.3.2.3 培养基 3
1.3.2.4 培养条件 4
1.3.3 植物悬浮细胞培养的优点 5
1.3.4 植物悬浮细胞培养的现状 5
1.3.2.1 前体的应用 5
1.3.2.2 诱导子的应用 6
1.4 本文研究内容 6
第二章 实验材料与方法 7
2.1 实验仪器与试剂 7
2.2 实验方法 8
2.2.1 桑愈伤组织的诱导 8
2.2.1 悬浮培养体系的建立 8
2.3 桑悬浮细胞细胞生长曲线的测定 9
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2.4 不同外源添加物对桑悬浮细胞次生物积累的影响 9
2.4.1 茉莉酸甲酯（MJ） 9
2.4.2 硝普钠（SNP） 9
2.4.3 冠菌素（COR） 9
2.4.4 苯丙氨酸 9
2.5 桑悬浮细胞中次生代谢产物含量的测定 10
2.5.1 黄酮含量的测定及标准曲线的绘制 10
2.5.1.1 黄酮标准曲线的绘制 10
2.5.1.2 黄酮的提取及测定 11
2.5.2 多糖含量的测定及标准曲线的绘制 11
2.5.2.1 多糖标准曲线的绘制 11
2.5.2.2 多糖的提取及测定 12
2.5.3 1DNJ含量的测定及标准曲线的绘制 12
2.5.3.1 1DNJ标准曲线的测定 12
2.5.3.2 1DNJ的提取 13
2.5.3.3 衍生化过程 13
2.5.3.4 色谱条件 13
2.5.3.5 部分试剂的制备 14
第三章 实验结果与分析 15
3.1 桑悬浮细胞生长曲线的绘制 15
3.2 不同外源添加物对桑悬浮细胞生长的影响 15
3.2.1 茉莉酸甲酯（MJ）对细胞生长的影响 15
3.2.2 硝普钠（SNP）对细胞生长的影响 16
3.2.3冠菌素（COR）对细胞生长的影响 17
3.2.4苯丙氨酸对细胞生长的影响 17
3.3 不同外源添加物对桑悬浮细胞次生物积累的影响 18
3.3.1 茉莉酸甲酯（MJ）对次生物积累的影响 18
3.3.1.1 茉莉酸甲酯（MJ）对黄酮积累的影响 18
3.3.1.2 茉莉酸甲酯（MJ）对多糖积累的影响 19
3.3.1.3茉莉酸甲酯（MJ）对1DNJ积累的影响 21
3.3.2 硝普钠（SNP）对次生物积累的影响 22
3.3.2.1 硝普钠（SNP）对黄酮积累的影响 22
3.3.2.2 硝普钠（SNP）对多糖积累的影响 23
3.3.2.3 硝普钠（SNP）对1DNJ积累的影响 24
3.3.3 冠菌素（COR）对次生物积累的影响 25
3.3.3.1 冠菌素（COR）对黄酮积累的影响 25
3.3.3.2 冠菌素（COR）对多糖积累的影响 27
3.3.4 苯丙氨酸对次生物积累的影响 28
3.3.4.1 苯丙氨酸对黄酮积累的影响 28
3.3.4.2 苯丙氨酸对多糖积累的影响 29
第四章 结论 31
致谢 32
参考文献 33
附录 37
第一章 绪论
1.1 桑的概述
桑树（Mulberry）为桑科桑属桑种植物，最早种植起源于我国，是人类历史文化中中华民族做出的贡献之一。桑树是一种栽种历史悠久的落叶乔木，桑树的栽培已有七千多年的历史，目前我国种植区域大部分分布于我国的中南部。我国收集和保存着世界上最多的桑树种类，共有15个桑种和3个变种[1,2]。桑树喜欢光照，能较好的适应生长所处的气候、土壤等环境，可以耐寒冻，但对水和湿度有较高的要求。能耐0.2 %以内的盐碱度。抗风，耐烟尘，抗有毒气体[3]。桑树全树皆有利用价值。桑叶主要作为家蚕的食物，桑皮用于造纸，桑果作为水果食用。研究表明桑树的叶、根、皮、嫩枝等具有药用价值[47]。
桑叶，别名铁扇子、神仙叶，是有名的中药药材。作为药用价值非常高的植物，桑叶中富含作为天然的强抗氧化剂所必须的大量稀有元素如有机硒和锗，这些稀有元素可以清除人体内的自由基，氧化堆积在人体内的毒素和废物，提高血液循环中的含氧量，促进人体的新陈代谢。在治疗三高人群、糖尿病患者、冠心病患者以及癌症术后的放化疗病人的康复都有着很好的辅助作用[6,7]。洗胰清糖素（CICS）是脱氧野尻霉素（DNJ）与葛根提取类黄酮物质结合形成的一种新物质，可以用于治降血糖、血脂。由于桑树本身的重要性和价值性也使得桑树的种植历史有如此长久[8]。
1.2 桑树中的活性成分
历代《本草》称桑树为东方神木“箕星之精”[5]。古人认为桑葚有补肝益肾、滋阴养血、黑发明目、祛斑延年的功效。现代药理的研究中也表明桑叶中确实有降血糖、降血压、抗菌和抗病毒等功效[9]。桑枝具有降血脂、抗氧化、降血糖和抗菌消炎等作用[4,7,9]。桑树中的次生物主要包括有黄酮类、多糖类和生物碱类三大功能性物质，从而使其成为药食同源的植物，此外桑树中还含有植物甾醇、γ 氨基丁酸和有益有机酸等多种有效活性成分[49]。
目录
第一章 绪论 1
1.1 桑的概述 1
1.2 桑树中的活性成分 1
1.3 桑树悬浮细胞培养 2
1.3.1 悬浮细胞培养概述 2
1.3.2 植物悬浮细胞培养的影响因素 3
1.3.2.1 外植体 3
1.3.2.2 愈伤组织 3
1.3.2.3 培养基 3
1.3.2.4 培养条件 4
1.3.3 植物悬浮细胞培养的优点 5
1.3.4 植物悬浮细胞培养的现状 5
1.3.2.1 前体的应用 5
1.3.2.2 诱导子的应用 6
1.4 本文研究内容 6
第二章 实验材料与方法 7
2.1 实验仪器与试剂 7
2.2 实验方法 8
2.2.1 桑愈伤组织的诱导 8
2.2.1 悬浮培养体系的建立 8
2.3 桑悬浮细胞细胞生长曲线的测定 9
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2.4 不同外源添加物对桑悬浮细胞次生物积累的影响 9
2.4.1 茉莉酸甲酯（MJ） 9
2.4.2 硝普钠（SNP） 9
2.4.3 冠菌素（COR） 9
2.4.4 苯丙氨酸 9
2.5 桑悬浮细胞中次生代谢产物含量的测定 10
2.5.1 黄酮含量的测定及标准曲线的绘制 10
2.5.1.1 黄酮标准曲线的绘制 10
2.5.1.2 黄酮的提取及测定 11
2.5.2 多糖含量的测定及标准曲线的绘制 11
2.5.2.1 多糖标准曲线的绘制 11
2.5.2.2 多糖的提取及测定 12
2.5.3 1DNJ含量的测定及标准曲线的绘制 12
2.5.3.1 1DNJ标准曲线的测定 12
2.5.3.2 1DNJ的提取 13
2.5.3.3 衍生化过程 13
2.5.3.4 色谱条件 13
2.5.3.5 部分试剂的制备 14
第三章 实验结果与分析 15
3.1 桑悬浮细胞生长曲线的绘制 15
3.2 不同外源添加物对桑悬浮细胞生长的影响 15
3.2.1 茉莉酸甲酯（MJ）对细胞生长的影响 15
3.2.2 硝普钠（SNP）对细胞生长的影响 16
3.2.3冠菌素（COR）对细胞生长的影响 17
3.2.4苯丙氨酸对细胞生长的影响 17
3.3 不同外源添加物对桑悬浮细胞次生物积累的影响 18
3.3.1 茉莉酸甲酯（MJ）对次生物积累的影响 18
3.3.1.1 茉莉酸甲酯（MJ）对黄酮积累的影响 18
3.3.1.2 茉莉酸甲酯（MJ）对多糖积累的影响 19
3.3.1.3茉莉酸甲酯（MJ）对1DNJ积累的影响 21
3.3.2 硝普钠（SNP）对次生物积累的影响 22
3.3.2.1 硝普钠（SNP）对黄酮积累的影响 22
3.3.2.2 硝普钠（SNP）对多糖积累的影响 23
3.3.2.3 硝普钠（SNP）对1DNJ积累的影响 24
3.3.3 冠菌素（COR）对次生物积累的影响 25
3.3.3.1 冠菌素（COR）对黄酮积累的影响 25
3.3.3.2 冠菌素（COR）对多糖积累的影响 27
3.3.4 苯丙氨酸对次生物积累的影响 28
3.3.4.1 苯丙氨酸对黄酮积累的影响 28
3.3.4.2 苯丙氨酸对多糖积累的影响 29
第四章 结论 31
致谢 32
参考文献 33
附录 37
第一章 绪论
1.1 桑的概述
桑树（Mulberry）为桑科桑属桑种植物，最早种植起源于我国，是人类历史文化中中华民族做出的贡献之一。桑树是一种栽种历史悠久的落叶乔木，桑树的栽培已有七千多年的历史，目前我国种植区域大部分分布于我国的中南部。我国收集和保存着世界上最多的桑树种类，共有15个桑种和3个变种[1,2]。桑树喜欢光照，能较好的适应生长所处的气候、土壤等环境，可以耐寒冻，但对水和湿度有较高的要求。能耐0.2 %以内的盐碱度。抗风，耐烟尘，抗有毒气体[3]。桑树全树皆有利用价值。桑叶主要作为家蚕的食物，桑皮用于造纸，桑果作为水果食用。研究表明桑树的叶、根、皮、嫩枝等具有药用价值[47]。
桑叶，别名铁扇子、神仙叶，是有名的中药药材。作为药用价值非常高的植物，桑叶中富含作为天然的强抗氧化剂所必须的大量稀有元素如有机硒和锗，这些稀有元素可以清除人体内的自由基，氧化堆积在人体内的毒素和废物，提高血液循环中的含氧量，促进人体的新陈代谢。在治疗三高人群、糖尿病患者、冠心病患者以及癌症术后的放化疗病人的康复都有着很好的辅助作用[6,7]。洗胰清糖素（CICS）是脱氧野尻霉素（DNJ）与葛根提取类黄酮物质结合形成的一种新物质，可以用于治降血糖、血脂。由于桑树本身的重要性和价值性也使得桑树的种植历史有如此长久[8]。
1.2 桑树中的活性成分
历代《本草》称桑树为东方神木“箕星之精”[5]。古人认为桑葚有补肝益肾、滋阴养血、黑发明目、祛斑延年的功效。现代药理的研究中也表明桑叶中确实有降血糖、降血压、抗菌和抗病毒等功效[9]。桑枝具有降血脂、抗氧化、降血糖和抗菌消炎等作用[4,7,9]。桑树中的次生物主要包括有黄酮类、多糖类和生物碱类三大功能性物质，从而使其成为药食同源的植物，此外桑树中还含有植物甾醇、γ 氨基丁酸和有益有机酸等多种有效活性成分[49]。
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