番茄iaa14基因的克隆表达及其生物信息学分析
摘要：植物根系发育对于植物吸收营养和水分非常重要，根系的形成主要是由各级侧根发育完成的。因此，植物侧根的形成对于植物的生长发育及其生产力形成有重要影响。IAA14基因是番茄(Solanum lycopersicum)生长素信号传导中的一个新基因。本实验选用“白果强丰”番茄提取IAA14基因作为研究对象。生物信息学分析显示，开放阅读框(ORF)有711 bp；同源性检测(BLAST)表明有9组基因与其有高相似性；保守结构域分析(CDD)预测确认，IAA14基因属于Aux/IAA基因家族；根据IAA14蛋白的特性分析，表明氨基酸残基数为236 bp，分子量为26242.0 Da；且属于富含赖氨酸(Lys)的不稳定的亲水性蛋白；亚细胞表达定位(Subcellular localization)结果显示该基因具有转录抑制因子的功能；由跨膜域结构分析(TMHMM)测得该基因无跨膜结构域，根据结构域分析及同源基因研究的对比，推测IAA14基因缺失在转录抑制方面的结构域。为后期IAA14基因在番茄的实际研究中提供了相关数据，具有重要的理论指导意义。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract1
Key words1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1主要材料与试剂 2
1.2 主要仪器 2
1.3方法3
1.3.1 IAA14基因的提取3
1.3.2 DNA电泳检测 3
1.3.3 DNA切胶回收与纯化 3
1.3.4 双酶切 4
1.3.5 T4DNA连接酶连接 4
1.3.6 大肠杆菌感受态细胞转化 4
1.3.7 挑菌 4
2 结果 4
2.1 cDNA检测结果 5
2.2 pET28a(+)IAA14表达载体的构建与鉴定 5
2.3 IAA14基因在大肠杆菌中蛋白序列的测定 5
2.4 生物信息学分析 6
2.4.1 BLAST6
2.4.2 IAA14成熟蛋白的基本特性分析 7
2.4.3 染色体定位 8
2.4
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
.4 ORF Finder8
2.4.5 TMHMM跨膜域分析 9
2.4.6亚细胞定位 10
3结论 10
致谢 10
参考文献 12
番茄IAA14基因的克隆、表达及其生物信息学分析
引言
西红柿又名番茄、洋柿子、狼桃、番李子等。其最初被视为有毒物的蔬菜，如今已经在我们日常饭桌上十分常见了。但是，对于这种植物的遗传机制，科学家们了解的还不多。2012年，由美国、英国、中国等14个国家的科学家组成的“番茄基因组研究国际协作组”经过8年多的艰苦努力，完成了对栽培番茄全基因组的精细序列分析。成果于2012年5月31日以封面文章发表在国际权威学术期刊《Nature》上[1]。高质量番茄基因组测序的完成极大地推动了番茄领域的研究发展。这些信息可用于培育优良的番茄品种，此外，在对抗病原体，干旱和瘟疫等方面，基因组序列也提供了重要信息。
生长素（auxin）是调控植物生长发育最重要的植物激素之一[2]。植物细胞和一些植物病原体均能合成生长素，并分别作用于调节植物自身的生长发育和病原体对植株的侵染[3]。生长素在植物的整个生命周期中均发挥着调控功能，如根和茎的发育生长、植物的向地和向光反应、管维束组织的形成和分化发育等。生长素/吲哚乙酸蛋白（Aux/IAAs）被认为与生长素信号转导相关的3类主要蛋白之一[4]。
Aux/IAA蛋白是生长素快速诱导的半衰期很短的核蛋白，有四个保守结构域：结构域Ⅰ、Ⅱ、Ш和Ⅳ。结构域Ⅰ负责抑制蛋白的活动，是主要的功能区域[5]，结构域Ⅱ是泛素化标记位点，通过标记此区域，蛋白被泛素化标记降解；结构域Ш和Ⅳ是Aux/IAA与生长素响应因子ARFs形成异源二聚体或与其他Aux/IAA家族成员形成同源或异源二聚体的区域[6]，生长素通过影响这种二聚体或多聚体的结构中相关蛋白的降解来控制下游基因的转录，从而在植物发育过程中发挥作用[7]。
IAA14基因属于Aux/IAA蛋白家族。番茄的IAA基因中都有结构域有Ш和Ⅳ[8]，只有IAA13、IAA16和IAA20缺少结构域Ⅰ和Ⅱ，表明IAA14的结构域俱全。研究显示，IAA4与拟南芥(Arabidopsis thaliana)的AtIAA14基因同源性相对较高[9]；转基因功能分析表明，该基因对番茄根系生长发育的影响与AtIAA14基因在拟南芥中表现的功能有相似之处，因此命名为IAA14[10]。由RNAi抑制IAA14基因的表达研究显示，IAA14基因可能通过影响侧根的起始部位来影响侧根的数目，且抑制IAA14基因的表达会增强番茄植株的生长素效应，由此说明该基因可能在生长素诱导根的形态建成中起着关键作用[1112]。以番茄为模式植物研究生长素信号传导相关的IAA基因的生物学功能，对解释番茄单性结实可能的分子机理，阐明生长素信号转导的复杂分子机制具有重要的理论意义和指导意义。
本实验通过对IAA14基因的克隆、表达，再利用转化后的测序结果进行生物信息学分析，为进一步研究该基因在生长素诱导下对番茄侧根的作用机制提供生物信息学资料。
1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂
番茄cDNA基因、大肠杆菌，原核表达载体pET28a(+)，DNA聚合酶，限制性内切酶，琼脂糖，琼脂粉，蛋白胨，酵母提取物，氯化钠，PCR产物纯化试剂盒，北京索莱宝公司（Solarbio）的GoldView I型核酸染色剂，青岛生物公司MDBio.Inc 2.5 ml dNTP，北京全式金生物10×EasyTaq Buffer，EasyTaqDNA Polymerase，赛默飞世尔公司ThermoScientific 10×FastDigest Green Buffer，T4DNA Ligase，T4DNA Ligase Buffer，FastDigest HindШ/BamH?，上海曼宝生物公司DLmarker 2000，AXYGEN APGX50G AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒等。
1.2 主要仪器
上海拜力生物移液枪，上海天能Tanon 5200 Multi，全自动荧光化学发光成像分析系统，上海天能UV2000紫外分析仪，北京六一双稳定时电泳仪DYY6C，精宏XMTD8222恒温水浴锅，赛默飞世尔公司ThermoScientific Nanodrop分光光度计2000/2000 C，美国Crystal精骐数显涡旋混匀器HYQ3110，德国Eppendorf 5417R小型台式高速冷冻离心机，美国Andybio迷你离心机，苏净安泰VS1300LU洁净工作台，上海恒科学仪器电热恒温培养箱，上海智城ZWYR240恒温摇床，生命快车PCR仪TC96/G/H(b)，BSA224S赛多利斯电子天平，超纯水仪，高压蒸汽灭菌锅，微波炉等。
1.3 方法
1.3.1 IAA14基因的提取
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract1
Key words1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1主要材料与试剂 2
1.2 主要仪器 2
1.3方法3
1.3.1 IAA14基因的提取3
1.3.2 DNA电泳检测 3
1.3.3 DNA切胶回收与纯化 3
1.3.4 双酶切 4
1.3.5 T4DNA连接酶连接 4
1.3.6 大肠杆菌感受态细胞转化 4
1.3.7 挑菌 4
2 结果 4
2.1 cDNA检测结果 5
2.2 pET28a(+)IAA14表达载体的构建与鉴定 5
2.3 IAA14基因在大肠杆菌中蛋白序列的测定 5
2.4 生物信息学分析 6
2.4.1 BLAST6
2.4.2 IAA14成熟蛋白的基本特性分析 7
2.4.3 染色体定位 8
2.4
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
.4 ORF Finder8
2.4.5 TMHMM跨膜域分析 9
2.4.6亚细胞定位 10
3结论 10
致谢 10
参考文献 12
番茄IAA14基因的克隆、表达及其生物信息学分析
引言
西红柿又名番茄、洋柿子、狼桃、番李子等。其最初被视为有毒物的蔬菜，如今已经在我们日常饭桌上十分常见了。但是，对于这种植物的遗传机制，科学家们了解的还不多。2012年，由美国、英国、中国等14个国家的科学家组成的“番茄基因组研究国际协作组”经过8年多的艰苦努力，完成了对栽培番茄全基因组的精细序列分析。成果于2012年5月31日以封面文章发表在国际权威学术期刊《Nature》上[1]。高质量番茄基因组测序的完成极大地推动了番茄领域的研究发展。这些信息可用于培育优良的番茄品种，此外，在对抗病原体，干旱和瘟疫等方面，基因组序列也提供了重要信息。
生长素（auxin）是调控植物生长发育最重要的植物激素之一[2]。植物细胞和一些植物病原体均能合成生长素，并分别作用于调节植物自身的生长发育和病原体对植株的侵染[3]。生长素在植物的整个生命周期中均发挥着调控功能，如根和茎的发育生长、植物的向地和向光反应、管维束组织的形成和分化发育等。生长素/吲哚乙酸蛋白（Aux/IAAs）被认为与生长素信号转导相关的3类主要蛋白之一[4]。
Aux/IAA蛋白是生长素快速诱导的半衰期很短的核蛋白，有四个保守结构域：结构域Ⅰ、Ⅱ、Ш和Ⅳ。结构域Ⅰ负责抑制蛋白的活动，是主要的功能区域[5]，结构域Ⅱ是泛素化标记位点，通过标记此区域，蛋白被泛素化标记降解；结构域Ш和Ⅳ是Aux/IAA与生长素响应因子ARFs形成异源二聚体或与其他Aux/IAA家族成员形成同源或异源二聚体的区域[6]，生长素通过影响这种二聚体或多聚体的结构中相关蛋白的降解来控制下游基因的转录，从而在植物发育过程中发挥作用[7]。
IAA14基因属于Aux/IAA蛋白家族。番茄的IAA基因中都有结构域有Ш和Ⅳ[8]，只有IAA13、IAA16和IAA20缺少结构域Ⅰ和Ⅱ，表明IAA14的结构域俱全。研究显示，IAA4与拟南芥(Arabidopsis thaliana)的AtIAA14基因同源性相对较高[9]；转基因功能分析表明，该基因对番茄根系生长发育的影响与AtIAA14基因在拟南芥中表现的功能有相似之处，因此命名为IAA14[10]。由RNAi抑制IAA14基因的表达研究显示，IAA14基因可能通过影响侧根的起始部位来影响侧根的数目，且抑制IAA14基因的表达会增强番茄植株的生长素效应，由此说明该基因可能在生长素诱导根的形态建成中起着关键作用[1112]。以番茄为模式植物研究生长素信号传导相关的IAA基因的生物学功能，对解释番茄单性结实可能的分子机理，阐明生长素信号转导的复杂分子机制具有重要的理论意义和指导意义。
本实验通过对IAA14基因的克隆、表达，再利用转化后的测序结果进行生物信息学分析，为进一步研究该基因在生长素诱导下对番茄侧根的作用机制提供生物信息学资料。
1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂
番茄cDNA基因、大肠杆菌，原核表达载体pET28a(+)，DNA聚合酶，限制性内切酶，琼脂糖，琼脂粉，蛋白胨，酵母提取物，氯化钠，PCR产物纯化试剂盒，北京索莱宝公司（Solarbio）的GoldView I型核酸染色剂，青岛生物公司MDBio.Inc 2.5 ml dNTP，北京全式金生物10×EasyTaq Buffer，EasyTaqDNA Polymerase，赛默飞世尔公司ThermoScientific 10×FastDigest Green Buffer，T4DNA Ligase，T4DNA Ligase Buffer，FastDigest HindШ/BamH?，上海曼宝生物公司DLmarker 2000，AXYGEN APGX50G AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒等。
1.2 主要仪器
上海拜力生物移液枪，上海天能Tanon 5200 Multi，全自动荧光化学发光成像分析系统，上海天能UV2000紫外分析仪，北京六一双稳定时电泳仪DYY6C，精宏XMTD8222恒温水浴锅，赛默飞世尔公司ThermoScientific Nanodrop分光光度计2000/2000 C，美国Crystal精骐数显涡旋混匀器HYQ3110，德国Eppendorf 5417R小型台式高速冷冻离心机，美国Andybio迷你离心机，苏净安泰VS1300LU洁净工作台，上海恒科学仪器电热恒温培养箱，上海智城ZWYR240恒温摇床，生命快车PCR仪TC96/G/H(b)，BSA224S赛多利斯电子天平，超纯水仪，高压蒸汽灭菌锅，微波炉等。
1.3 方法
1.3.1 IAA14基因的提取
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