新辅酶吡咯喹啉醌（PQQ）的合成（二）
新辅酶吡咯喹啉醌（PQQ）的合成（二）[20200411154300]
摘要
吡咯喹啉醌(PQQ)是20世纪70年代末发现的一种可与烟酞胺核昔酸、黄素核昔酸作用的辅基，是一种氧化还原新辅酶。其分子结构中的独特醌式结构，使其具有优良的理化性质，在生理功能方面发挥着重要的作用。以PQQ为辅酶的酶蛋白在实际生产中有着非常广泛的用途。
本论文主要以6-（甲酰氨基）-5-甲氧基吲哚-2-羧酸-乙基酯为原料，经过酰胺水解6-氨基-5-甲氧基吲哚-2-羧酸乙酯，然后，与合成的2-氧代戊烯二酸二甲酯进行迈克加成及偶联环化得到顺-6，7，8，9-四氢-9羟基-5-甲氧基-1H-吡咯并[2,3-f]喹啉-2，7，9-三羧基-（2-乙基）（7，9-二甲基）酯，接着，对产物进行氧化得到4，5-二氢-4，5-二氧代-1-H并[2,3-f]喹啉-2，7，9-三羧基-（2-乙基）（7，9-二甲基）酯，最后进行水解得到4，5-二氢-4，5-二氧代-1-H并[2,3-f]喹啉-2，7，9-三羧酸即PQQ。实验过程中由于最后的产物是羧基，难以水解，以至于产物偏低，产率只有14.5 %，通过不断改进、优化，我们找到一条快速、高效的化学合成路径，为工业化生产打下基础。
*查看完整论文请 +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:吡咯喹啉醌新辅酶合成ThesynthesisofNewCoenzymePyrroleQuinone(PQQ)(2)
目 录
1 引言 1
1.1新辅酶吡咯喹啉醌(PQQ)的简介 1
1.1.1新辅酶吡咯喹啉醌(PQQ)化合物 1
1.1.2新辅酶吡咯喹啉醌(PQQ)的生物功能 2
1.1.3新辅酶吡咯喹啉醌(PQQ)的应用 4
1.2新辅酶吡咯喹啉醌(PQQ)的合成 5
1.2.1新辅酶吡咯喹啉醌(PQQ)的化学合成 5
1.2.2新辅酶吡咯喹啉醌(PQQ)的生物合成 8
1.3本论文的目的和意义 10
2.实验部分 11
2.1主要实验仪器和原料 11
2.1.1实验仪器 11
2.1.2 主要原料及物理性质 11
2.2新辅酶吡咯喹啉醌PPQ的合成步骤 12
3.实验结果与讨论 14
3.1对PQQ各步骤产率及优化条件的讨论 14
3.2产物的核磁共振图 17
3.2.1 6-氨基-5-甲氧基吲哚-2-羧酸乙酯的氢谱图 17
3.2.2 顺-6，7，8，9-四氢-9羟基-5-甲氧基-1H-吡咯并[2,3-f]喹啉-2，7，9-三羧基-（2-乙基）（7，9-二甲基）酯的氢谱图 18
3.2.3 4，5-二氢-4，5-二氧代-1-H并[2,3-f]喹啉-2，7，9-三羧基-（2-乙基）（7，9-二甲基）酯的氢谱图 19
3.3产物的红外分析图 20
3.3.1 6-氨基-5-甲氧基吲哚-2-羧酸乙酯的红外图 20
3.3.2 顺-6，7，8，9-四氢-9羟基-5-甲氧基-1H-吡咯并[2,3-f]喹啉-2，7，9-三羧基-（2-乙基）（7，9-二甲基）酯的红外图 21
结语 22
参考文献 23
致谢 24
1 引言
随着社会的发展和人们的健康食品和营养，不断追求进步，医药食品，PQQ具有多种重要的生理功能：某些植物的生长和微生物与人类细胞生长刺激；要素作为动物生长发育；清除自由基，保护身体免受自由基损伤的预防和治疗肝损伤；防治肝损伤;增进生长因子合成等[1]。所以，在医药应用等方面PQQ具有一定的应用前景。目前有关PQQ的研究虽取得了一定进展,但还不系统、不全面,特别是相应的作用机制了解得很肤浅。随着人们对PQQ的性质、功能及其二者之间关系深入了解,PQQ有望成为一种具有多种治疗用途的新型医药制品。但是目前还是没有关于成熟的工业化路线来规模化生产吡咯喹啉醌（PQQ）的报道。
本论文基于目前研究的成果，扩大合成的应用面。实验室完成全合成路线制备高纯度的PQQ；优化实验条件，增加产量，提高实验室PQQ总的合成路线，得到优化的路径。在合成路线，生产风险和高能耗等不适合工业化生产的优化和改进，在实验室中探索更适宜的合成路线。
1.1新辅酶吡咯喹啉醌(PQQ)的简介
1.1.1新辅酶吡咯喹啉醌(PQQ)化合物
吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone， PQQ）是醌蛋白（一种细菌脱氢酶）的有机氧化还原辅因子，也是一种新的B族维生素[1]。PQQ的分子量为330，研究表明，最先是从微生物中被发现的，高等真核生物体内也有PQQ存在，其化学结构如图所示。
图1
PQQ的化学结构
在这个酶液中加入适当的甲醇，离心，上层清液用Amberlyst离子交换柱过柱，首先用甲醇水溶液润洗，然后用甲醇水溶液洗脱，这个甲醇溶液中含饱和氯化钠，纯化的吡咯喹啉醌，颜色是砖红色，他们还用近似的方法直接从吡咯喹啉醌的细菌细胞提取物[2]。该化合物首先被从细菌中分离出来的, 动、植物体内也在随后的研究中被发现了。它的化学名称为4,5-二氢-4,5-二氧化-1-氢吡咯醌(2,3f)-2,7,9一三梭酸,又名methxaati[3]。分布，理化性质，结构和功能，生物合成基因及其他方面的一系列研究。PQQ因为它奇特的邻苯醌构造赋与了它与别的辅酶很多不同的生理特征，这样它便具有了与其他辅助酶不同的生理功能。辅酶PQQ可许多氧化还原酶，所以它在酶促反应起着如许多功能：电子转移，质子和化学基团。目前PQQ已被归入B族维生素，是人体必需的一种营养因子。自从PQQ被发现以来，关于它在自然界中的分布就成为科学家们探索的热点问题。由于受到PQQ检测手段的限制，使对其分布的确定变得有些困难。目前普遍认为，PQQ主要存在于某些革兰氏阴性菌的一些脱氢酶中，在某些革兰氏阳性菌中也有发现，另外在某些植物的叶子中以及哺乳动物体液和器官中，也发现PQQ的存在。虽然PQQ广泛的存在于细菌、植物和动物等生物体内，但目前证实仅一些革兰氏阴性细菌可合成PQQ。另外，自然界还存在一些细菌仅合成醌蛋白的酶蛋白部分，而不合成辅酶PQQ，当在基质中加入PQQ后，可组合为有活性的全酶，比如大肠杆菌（Escherichiacoli）中的Glucose dehydrogenase（GDH）[4]。
1.1.2新辅酶吡咯喹啉醌(PQQ)的生物功能
a. 参与电子转移：辅酶PQQ许多醌酶参与醌的电子转移的酶，它可以帮助醌酶实现其特定的生物学功能。在电子传递过程中醌酶不完全相同。乙醇氧化的初始阶段是由醋酸菌的乙醇脱氢酶（ADH）掌管的。
b.加强微生物的适应能力在极端环境:吡咯喹啉醌可以增强微生物对辐射的抗性，而且通过介入DNA毁伤建设的信号转导，周质蛋白激酶的活性能被它选择性引诱，它可以将宿主菌抗氧化压力的能力得到提高，而且使非氧化放射和 DNA损伤剂不能对宿主造成损伤。从同一个含有PQQ合成酶大肠杆菌耐辐射菌株的发现，PQQ能使蛋白激酶yygl活性蛋白是从周质蛋白激酶猛烈的刺激中获得的，并使YygL参与大肠杆菌的DNA损伤修复的信号转导。对大肠杆菌用紫外线处理后，导入PQQ合成基因的大肠杆菌，与之前相比，它能使大肠杆菌存活了近4日志周期增加，同时利用γ射线对它，大肠杆菌的抗性更是比野生菌高10倍。之所以大肠杆菌的辐射抗性得到了大大的提高，是因为PQQ对YygL蛋白和必需蛋白的重组修复。
有些PQQ生产菌不仅能够适应环境，而且也可以参与特定物质的循环，如赤细菌属菌株SD21，PQQ可以引诱它二价锰氧化酶的活性，以确保其正常生理功能的前提下，它是在自然循环中锰的参与，除了广泛存在的PQQ在不同细菌的极端环境下产生的外部，如酸性环境（氧化葡萄糖酸杆菌，解纤维热酸菌等)和高温厌氧环境(霍氏热球菌，硫磺矿硫化叶菌等)。
d. 刺激微生物的生长和发育，植物和人类的细胞：amycama找到的许多物质，如酵母提取物，番茄提取物含刺激微生物的生长，如醋酸菌荧光假单胞菌成分，这部分是分析证实PQQ，生长延迟时间可明显缩短微生物不影响指数相生长速率和生物量。低浓度PQQ(3~30nmof/L)能够有效刺激培养的人成纤维细胞DNA合成,显著增加细胞密度,其功效强于成纤维细胞生长因子和胰岛素生长因子,与上皮生长因子相当; 高浓度PQQ大于（300umol／L）则会抑制DNA的合成，降解并造成的细胞死亡，和PQQ（PQQ和甘氨酸反应产物）没有这种毒性作用。Yamgauchi等(1993)报导PQQ能使活的老鼠脑中神经生长因子(NGF)的产量得到增高,但离体培育的神经细胞它对这些是不起作用; 分离的神经细胞产生神经生长因子，PQQ能促进其生产。
摘要
吡咯喹啉醌(PQQ)是20世纪70年代末发现的一种可与烟酞胺核昔酸、黄素核昔酸作用的辅基，是一种氧化还原新辅酶。其分子结构中的独特醌式结构，使其具有优良的理化性质，在生理功能方面发挥着重要的作用。以PQQ为辅酶的酶蛋白在实际生产中有着非常广泛的用途。
本论文主要以6-（甲酰氨基）-5-甲氧基吲哚-2-羧酸-乙基酯为原料，经过酰胺水解6-氨基-5-甲氧基吲哚-2-羧酸乙酯，然后，与合成的2-氧代戊烯二酸二甲酯进行迈克加成及偶联环化得到顺-6，7，8，9-四氢-9羟基-5-甲氧基-1H-吡咯并[2,3-f]喹啉-2，7，9-三羧基-（2-乙基）（7，9-二甲基）酯，接着，对产物进行氧化得到4，5-二氢-4，5-二氧代-1-H并[2,3-f]喹啉-2，7，9-三羧基-（2-乙基）（7，9-二甲基）酯，最后进行水解得到4，5-二氢-4，5-二氧代-1-H并[2,3-f]喹啉-2，7，9-三羧酸即PQQ。实验过程中由于最后的产物是羧基，难以水解，以至于产物偏低，产率只有14.5 %，通过不断改进、优化，我们找到一条快速、高效的化学合成路径，为工业化生产打下基础。
*查看完整论文请 +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:吡咯喹啉醌新辅酶合成ThesynthesisofNewCoenzymePyrroleQuinone(PQQ)(2)
目 录
1 引言 1
1.1新辅酶吡咯喹啉醌(PQQ)的简介 1
1.1.1新辅酶吡咯喹啉醌(PQQ)化合物 1
1.1.2新辅酶吡咯喹啉醌(PQQ)的生物功能 2
1.1.3新辅酶吡咯喹啉醌(PQQ)的应用 4
1.2新辅酶吡咯喹啉醌(PQQ)的合成 5
1.2.1新辅酶吡咯喹啉醌(PQQ)的化学合成 5
1.2.2新辅酶吡咯喹啉醌(PQQ)的生物合成 8
1.3本论文的目的和意义 10
2.实验部分 11
2.1主要实验仪器和原料 11
2.1.1实验仪器 11
2.1.2 主要原料及物理性质 11
2.2新辅酶吡咯喹啉醌PPQ的合成步骤 12
3.实验结果与讨论 14
3.1对PQQ各步骤产率及优化条件的讨论 14
3.2产物的核磁共振图 17
3.2.1 6-氨基-5-甲氧基吲哚-2-羧酸乙酯的氢谱图 17
3.2.2 顺-6，7，8，9-四氢-9羟基-5-甲氧基-1H-吡咯并[2,3-f]喹啉-2，7，9-三羧基-（2-乙基）（7，9-二甲基）酯的氢谱图 18
3.2.3 4，5-二氢-4，5-二氧代-1-H并[2,3-f]喹啉-2，7，9-三羧基-（2-乙基）（7，9-二甲基）酯的氢谱图 19
3.3产物的红外分析图 20
3.3.1 6-氨基-5-甲氧基吲哚-2-羧酸乙酯的红外图 20
3.3.2 顺-6，7，8，9-四氢-9羟基-5-甲氧基-1H-吡咯并[2,3-f]喹啉-2，7，9-三羧基-（2-乙基）（7，9-二甲基）酯的红外图 21
结语 22
参考文献 23
致谢 24
1 引言
随着社会的发展和人们的健康食品和营养，不断追求进步，医药食品，PQQ具有多种重要的生理功能：某些植物的生长和微生物与人类细胞生长刺激；要素作为动物生长发育；清除自由基，保护身体免受自由基损伤的预防和治疗肝损伤；防治肝损伤;增进生长因子合成等[1]。所以，在医药应用等方面PQQ具有一定的应用前景。目前有关PQQ的研究虽取得了一定进展,但还不系统、不全面,特别是相应的作用机制了解得很肤浅。随着人们对PQQ的性质、功能及其二者之间关系深入了解,PQQ有望成为一种具有多种治疗用途的新型医药制品。但是目前还是没有关于成熟的工业化路线来规模化生产吡咯喹啉醌（PQQ）的报道。
本论文基于目前研究的成果，扩大合成的应用面。实验室完成全合成路线制备高纯度的PQQ；优化实验条件，增加产量，提高实验室PQQ总的合成路线，得到优化的路径。在合成路线，生产风险和高能耗等不适合工业化生产的优化和改进，在实验室中探索更适宜的合成路线。
1.1新辅酶吡咯喹啉醌(PQQ)的简介
1.1.1新辅酶吡咯喹啉醌(PQQ)化合物
吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone， PQQ）是醌蛋白（一种细菌脱氢酶）的有机氧化还原辅因子，也是一种新的B族维生素[1]。PQQ的分子量为330，研究表明，最先是从微生物中被发现的，高等真核生物体内也有PQQ存在，其化学结构如图所示。
图1
PQQ的化学结构
在这个酶液中加入适当的甲醇，离心，上层清液用Amberlyst离子交换柱过柱，首先用甲醇水溶液润洗，然后用甲醇水溶液洗脱，这个甲醇溶液中含饱和氯化钠，纯化的吡咯喹啉醌，颜色是砖红色，他们还用近似的方法直接从吡咯喹啉醌的细菌细胞提取物[2]。该化合物首先被从细菌中分离出来的, 动、植物体内也在随后的研究中被发现了。它的化学名称为4,5-二氢-4,5-二氧化-1-氢吡咯醌(2,3f)-2,7,9一三梭酸,又名methxaati[3]。分布，理化性质，结构和功能，生物合成基因及其他方面的一系列研究。PQQ因为它奇特的邻苯醌构造赋与了它与别的辅酶很多不同的生理特征，这样它便具有了与其他辅助酶不同的生理功能。辅酶PQQ可许多氧化还原酶，所以它在酶促反应起着如许多功能：电子转移，质子和化学基团。目前PQQ已被归入B族维生素，是人体必需的一种营养因子。自从PQQ被发现以来，关于它在自然界中的分布就成为科学家们探索的热点问题。由于受到PQQ检测手段的限制，使对其分布的确定变得有些困难。目前普遍认为，PQQ主要存在于某些革兰氏阴性菌的一些脱氢酶中，在某些革兰氏阳性菌中也有发现，另外在某些植物的叶子中以及哺乳动物体液和器官中，也发现PQQ的存在。虽然PQQ广泛的存在于细菌、植物和动物等生物体内，但目前证实仅一些革兰氏阴性细菌可合成PQQ。另外，自然界还存在一些细菌仅合成醌蛋白的酶蛋白部分，而不合成辅酶PQQ，当在基质中加入PQQ后，可组合为有活性的全酶，比如大肠杆菌（Escherichiacoli）中的Glucose dehydrogenase（GDH）[4]。
1.1.2新辅酶吡咯喹啉醌(PQQ)的生物功能
a. 参与电子转移：辅酶PQQ许多醌酶参与醌的电子转移的酶，它可以帮助醌酶实现其特定的生物学功能。在电子传递过程中醌酶不完全相同。乙醇氧化的初始阶段是由醋酸菌的乙醇脱氢酶（ADH）掌管的。
b.加强微生物的适应能力在极端环境:吡咯喹啉醌可以增强微生物对辐射的抗性，而且通过介入DNA毁伤建设的信号转导，周质蛋白激酶的活性能被它选择性引诱，它可以将宿主菌抗氧化压力的能力得到提高，而且使非氧化放射和 DNA损伤剂不能对宿主造成损伤。从同一个含有PQQ合成酶大肠杆菌耐辐射菌株的发现，PQQ能使蛋白激酶yygl活性蛋白是从周质蛋白激酶猛烈的刺激中获得的，并使YygL参与大肠杆菌的DNA损伤修复的信号转导。对大肠杆菌用紫外线处理后，导入PQQ合成基因的大肠杆菌，与之前相比，它能使大肠杆菌存活了近4日志周期增加，同时利用γ射线对它，大肠杆菌的抗性更是比野生菌高10倍。之所以大肠杆菌的辐射抗性得到了大大的提高，是因为PQQ对YygL蛋白和必需蛋白的重组修复。
有些PQQ生产菌不仅能够适应环境，而且也可以参与特定物质的循环，如赤细菌属菌株SD21，PQQ可以引诱它二价锰氧化酶的活性，以确保其正常生理功能的前提下，它是在自然循环中锰的参与，除了广泛存在的PQQ在不同细菌的极端环境下产生的外部，如酸性环境（氧化葡萄糖酸杆菌，解纤维热酸菌等)和高温厌氧环境(霍氏热球菌，硫磺矿硫化叶菌等)。
d. 刺激微生物的生长和发育，植物和人类的细胞：amycama找到的许多物质，如酵母提取物，番茄提取物含刺激微生物的生长，如醋酸菌荧光假单胞菌成分，这部分是分析证实PQQ，生长延迟时间可明显缩短微生物不影响指数相生长速率和生物量。低浓度PQQ(3~30nmof/L)能够有效刺激培养的人成纤维细胞DNA合成,显著增加细胞密度,其功效强于成纤维细胞生长因子和胰岛素生长因子,与上皮生长因子相当; 高浓度PQQ大于（300umol／L）则会抑制DNA的合成，降解并造成的细胞死亡，和PQQ（PQQ和甘氨酸反应产物）没有这种毒性作用。Yamgauchi等(1993)报导PQQ能使活的老鼠脑中神经生长因子(NGF)的产量得到增高,但离体培育的神经细胞它对这些是不起作用; 分离的神经细胞产生神经生长因子，PQQ能促进其生产。
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