生物质炭施用对茶园土壤n2o排放的影响及其关联微生物机制研究(附件)
本研究以苏南太湖地区茶园酸性土壤为对象，通过四种施肥处理（对照处理CK、生物质炭B、氮肥N、氮肥和生物质炭NB）的室内培养实验，探究影响茶园土壤N2O排放的主要驱动因子，利用q-PCR技术研究反硝化功能基因（nirK、nirS 和nosZ）的丰度变化，揭示生物质炭施用对茶园土壤N2O排放的影响及耦合的微生物机理。实验结果(1)生物质炭施用显著减少茶园土壤N2O排放；(2)pH值先升后降，N2O排放与土壤pH呈显著负相关；(3)nirK、nirS、nosZ丰度分别呈缓慢上升、波动、先升后降的动态，N2O排放与nirK基因丰度呈显著正相关，与nosZ基因丰度呈极显著负相关。研究表明，施加生物质炭提高土壤pH是N2O减排的关键非生物因子，而增加nosZ基因的丰度、提高N2O还原酶的活性是N2O减排的关键性生物因子。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法3
1.1 材料 3
1.2 方法 4
1.2.1 田间试验4
1.2.2 室内培养实验5
1.2.3 土壤理化指标的测定5
1.2.4 微生物过程的分子生物学分析6
1.2.5 统计分析7
2 结果与分析7
2.1 生物质炭对土壤N2O排放的影响7
2.2 生物质炭对土壤矿质氮含量的影响7
2.3 生物质炭对土壤pH的影响8
2.4 生物质炭对土壤反硝化相关功能基因丰度的影响9
2.5 驱动土壤N2O排放的主要因子 11
3讨论12
4结论13
致谢13
参考文献14
生物质炭施用对茶园土壤N2O排放的影响及其关联微生物机制研究
引言
大气温室气体中，N2O寿命极长。相比工业革命前，如今大气中氧化亚氮浓度已经是1750年270 ppbv（109体积比）的1.2倍，其导致的辐射强迫增加0.16 W m2 [1] 。除导致温室效应外，大气中N2O还可与D电离层的氧原子发生反应生成NO，并进一步与同 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
温层的臭氧（O3）发生反应，从而消耗O3，破坏臭氧层，到达地球表面的紫外辐射增加，人类的生存环境遭到危害。
在N2O产生的许多来源中，土壤是其重要排放源[24] 。过去半个世纪以来，学者们对各种生态系统土壤氧化亚氮排放进行了大量观测研究。影响土壤N2O排放的主要因素包括氮肥施用、土壤氮含量、气候、土地利用方式、土壤有机碳含量、pH和容重、以及观测周期与频率等[5,6]。这些研究主要集中在自然生态系统（森林和草地）、大田粮食作物种植系统（稻田和旱作粮田）以及菜地[7,8]然而，近年来由于土地利用方式变化，一些半自然生态系统（如经营性茶园生态系统）中施肥引起的土壤N2O和氮氧化物排放量较高，成为国际研究热点。
中国是茶树种植大国。茶树是喜酸性土壤的作物，但并非土壤pH值越低茶树生长状况就越好。由于长期氮肥施用、酸雨酸沉降等原因，茶园土壤酸化进程不断加剧。此外众多研究发现，酸性土壤环境下会排放大量N2O[9,10]，且N2O排放量随pH下降而呈上升动态[11]。
一般认为，土壤氧化亚氮主要通过土壤微生物参与的氮素循环过程产生，是硝化作用和反硝化作用的中间产物[12]，功能微生物在此循环过程中起到了突出作用。图1描述了土壤中氮素循环及其相关的功能基因[13]，深入解释了土壤N2O产生的微生物机制。硝化作用的第一步是亚硝化，NH4+在氨氧化菌（ammoniaoxidizing archaea/bacteria，AOA/AOB）的作用下通过两步反应被氧化成NO2：第一步是主要的限速步骤，即氨被氧化成羟胺（NH2OH）的过程，氨单加氧酶起到重要催化作用；第二步是羟胺在羟胺氧化酶的催化作用下氧化成NO2，氧化亚氮作为羟胺氧化过程的副产物产生。amoA是亚硝化过程中编码氨单加氧酶α亚基的功能基因，被大量用于检测氨氧化微生物的群落结构[14]。硝化作用的第二步是硝化，即一部分亚硝酸根在氮氧化细菌（nitriteoxidizing bacteria，NOB）的作用下被氧化为硝酸根，由亚硝酸氧化还原酶（nitrite oxidoreductase, NXR）催化合成[15]。这个由NH4+在微生物作用下逐步形成NO3的过程就是硝化作用。日本学者发现硝化作用发生的pH值环境可以低至2.9[16]。比起荒地和林地，在酸性茶园土壤中发生的净硝化作用更加活跃[17]。
图1 土壤N2O形成的微生物机制
Fig.1 The microbial mechanism of N2O emission in soils
与此同时，氧化亚氮也在通过茶园土壤中的反硝化作用不断产生。该还原反应过程为：NO3→NO2→NO→N2O→N2。日本科学家釆用15N示踪法发现[18]，茶园土壤氧化亚氮主要通过反硝化作用产生。首先，硝酸根在微生物产生的硝酸还原酶（nitrate reductase，编码基因为narG）的作用下被还原为亚硝酸根。随后亚硝酸根在亚硝酸还原酶（nitrite reductase，编码基因为nirS和nirK）的催化作用下被还原为一氧化氮。而一氧化氮在一氧化氮还原酶（nitric oxidereductase，编码基因为norB）的作用下还原为氧化亚氮，其中一部分N2O会直接散发到大气中，造成温室效应[19]；而另一部分N2O会在氧化亚氮还原酶（nitrous oxide reductase）的作用下转化为无害的N2并释放到环境中[20]。氧化亚氮还原酶的编码基因是nosZ[21]，它是一个关键的功能基因。土壤pH是影响上述过程的重要因素之一[22]。酸性低pH环境下，反硝化作用的产物主要为氧化亚氮，研究认为氧化亚氮还原酶的活性被较低的pH有所抑制[2325]。
尽管茶园生态系统中存在大量产N2O微生物，但可供纯培养的微生物数量极少，需采用以DNA为基础的分子生物学技术，例如核糖体DNA (rDNA) 扩增测序、荧光定量PCR等，提供更多的群落组成和动态变化信息。土壤微生物群落组成是影响N2O排放机制的重要因子，其中携带nosZ基因的微生物丰度更加关键[26]。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法3
1.1 材料 3
1.2 方法 4
1.2.1 田间试验4
1.2.2 室内培养实验5
1.2.3 土壤理化指标的测定5
1.2.4 微生物过程的分子生物学分析6
1.2.5 统计分析7
2 结果与分析7
2.1 生物质炭对土壤N2O排放的影响7
2.2 生物质炭对土壤矿质氮含量的影响7
2.3 生物质炭对土壤pH的影响8
2.4 生物质炭对土壤反硝化相关功能基因丰度的影响9
2.5 驱动土壤N2O排放的主要因子 11
3讨论12
4结论13
致谢13
参考文献14
生物质炭施用对茶园土壤N2O排放的影响及其关联微生物机制研究
引言
大气温室气体中，N2O寿命极长。相比工业革命前，如今大气中氧化亚氮浓度已经是1750年270 ppbv（109体积比）的1.2倍，其导致的辐射强迫增加0.16 W m2 [1] 。除导致温室效应外，大气中N2O还可与D电离层的氧原子发生反应生成NO，并进一步与同 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
温层的臭氧（O3）发生反应，从而消耗O3，破坏臭氧层，到达地球表面的紫外辐射增加，人类的生存环境遭到危害。
在N2O产生的许多来源中，土壤是其重要排放源[24] 。过去半个世纪以来，学者们对各种生态系统土壤氧化亚氮排放进行了大量观测研究。影响土壤N2O排放的主要因素包括氮肥施用、土壤氮含量、气候、土地利用方式、土壤有机碳含量、pH和容重、以及观测周期与频率等[5,6]。这些研究主要集中在自然生态系统（森林和草地）、大田粮食作物种植系统（稻田和旱作粮田）以及菜地[7,8]然而，近年来由于土地利用方式变化，一些半自然生态系统（如经营性茶园生态系统）中施肥引起的土壤N2O和氮氧化物排放量较高，成为国际研究热点。
中国是茶树种植大国。茶树是喜酸性土壤的作物，但并非土壤pH值越低茶树生长状况就越好。由于长期氮肥施用、酸雨酸沉降等原因，茶园土壤酸化进程不断加剧。此外众多研究发现，酸性土壤环境下会排放大量N2O[9,10]，且N2O排放量随pH下降而呈上升动态[11]。
一般认为，土壤氧化亚氮主要通过土壤微生物参与的氮素循环过程产生，是硝化作用和反硝化作用的中间产物[12]，功能微生物在此循环过程中起到了突出作用。图1描述了土壤中氮素循环及其相关的功能基因[13]，深入解释了土壤N2O产生的微生物机制。硝化作用的第一步是亚硝化，NH4+在氨氧化菌（ammoniaoxidizing archaea/bacteria，AOA/AOB）的作用下通过两步反应被氧化成NO2：第一步是主要的限速步骤，即氨被氧化成羟胺（NH2OH）的过程，氨单加氧酶起到重要催化作用；第二步是羟胺在羟胺氧化酶的催化作用下氧化成NO2，氧化亚氮作为羟胺氧化过程的副产物产生。amoA是亚硝化过程中编码氨单加氧酶α亚基的功能基因，被大量用于检测氨氧化微生物的群落结构[14]。硝化作用的第二步是硝化，即一部分亚硝酸根在氮氧化细菌（nitriteoxidizing bacteria，NOB）的作用下被氧化为硝酸根，由亚硝酸氧化还原酶（nitrite oxidoreductase, NXR）催化合成[15]。这个由NH4+在微生物作用下逐步形成NO3的过程就是硝化作用。日本学者发现硝化作用发生的pH值环境可以低至2.9[16]。比起荒地和林地，在酸性茶园土壤中发生的净硝化作用更加活跃[17]。
图1 土壤N2O形成的微生物机制
Fig.1 The microbial mechanism of N2O emission in soils
与此同时，氧化亚氮也在通过茶园土壤中的反硝化作用不断产生。该还原反应过程为：NO3→NO2→NO→N2O→N2。日本科学家釆用15N示踪法发现[18]，茶园土壤氧化亚氮主要通过反硝化作用产生。首先，硝酸根在微生物产生的硝酸还原酶（nitrate reductase，编码基因为narG）的作用下被还原为亚硝酸根。随后亚硝酸根在亚硝酸还原酶（nitrite reductase，编码基因为nirS和nirK）的催化作用下被还原为一氧化氮。而一氧化氮在一氧化氮还原酶（nitric oxidereductase，编码基因为norB）的作用下还原为氧化亚氮，其中一部分N2O会直接散发到大气中，造成温室效应[19]；而另一部分N2O会在氧化亚氮还原酶（nitrous oxide reductase）的作用下转化为无害的N2并释放到环境中[20]。氧化亚氮还原酶的编码基因是nosZ[21]，它是一个关键的功能基因。土壤pH是影响上述过程的重要因素之一[22]。酸性低pH环境下，反硝化作用的产物主要为氧化亚氮，研究认为氧化亚氮还原酶的活性被较低的pH有所抑制[2325]。
尽管茶园生态系统中存在大量产N2O微生物，但可供纯培养的微生物数量极少，需采用以DNA为基础的分子生物学技术，例如核糖体DNA (rDNA) 扩增测序、荧光定量PCR等，提供更多的群落组成和动态变化信息。土壤微生物群落组成是影响N2O排放机制的重要因子，其中携带nosZ基因的微生物丰度更加关键[26]。
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