番茄青枯病拮抗菌的筛选及生物学特性研究
摘要：番茄青枯病又称细菌性枯萎病是由青枯菌导致的一种毁灭性土传病害，是在番茄上经常出现的维管束系统性病害之一，尤其在连作条件下，一旦发病严重就可能造成植株青枯死亡，导致减产甚至绝收。对于这种病害的治理主要是采用培育抗病种类、使用轮作方式和喷洒农药等举措，但因为各种条件的限制，防治的效果相当不好。利用生物防治的方法来治理番茄青枯病是目前的研究热点和发展方向。 本文通过稀释平板法筛选出高效的番茄青枯病拮抗菌，通过形态观察，16S rRNA基因序列分析和生理生化特性初步鉴定为芽孢杆菌。通过对其生长条件的研究，发现其最适生长温度为30℃，最佳碳源为淀粉，氮源为蛋白胨。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1青枯菌株2
1.2.1分离土壤2
1.2.1培养基2
1.2方法 2
1.2.1拮抗菌的分离筛选、鉴定及生化性质研究2
1.2.2拮抗菌株的16S rRNA基因序列的分析2
1.2.3不同培养条件下拮抗菌生长的测定3
1.2.4番茄根系分泌物对拮抗菌生长的影响3
2结果与分析3
2.1拮抗菌株的分筛选3
2.2拮抗菌株的形态特性4
2.3拮抗菌株的抗生素敏感性4
2.4拮抗菌株的16S rRNA基因序列分析5
2.5不同培养条件对拮抗菌生长的影响5
2.6番茄根系分泌物对拮抗菌生长的影响8
3讨论 8
致谢9
参考文献9
番茄青枯病拮抗菌的筛选及生物学特性研究
引言
引言
番茄是全世界栽培最为广泛的果菜之一，我国为主要生产国之一，全国各地普遍种植[1]。但番茄连作时，土传病害十分严重，其中，番茄青枯病是重要的病害之一，该病是由茄科劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）导致的一种毁灭性土传细菌病害[2]，发病率一般高达80%以上，严重时造成绝收，给番茄生产带来
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
极大的威胁[3]。使用生防菌防治土传病害，已成为植物病害生物防治工作的研究热点[4]。生防菌的定殖能力是生防菌发挥作用的重要因素[5]。在本研究中把生长速度和竞争力作为首要筛选标准，筛选快速利用番茄根系分泌物和根组织的菌株（在短时间内快速生长的必定是竞争力强的菌株），再从中筛选对病原菌具备拮抗能力的菌株[6]。在此基础上研究其生物学性状，并验证对青枯病的防效及对番茄根系微生物区系的影响，这对于控制番茄青枯病，促进温室蔬菜的健康发展，提高经济效益具有重要的指导意义。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 青枯菌株
番茄青枯病病原菌由实验室提供，经致病性试验鉴定，该菌株为强致病力菌株
1．1．2 分离土壤
用于分离拮抗菌的土壤为取自健康番茄植株的根际土壤
1．1．3 培养基
LB培养基（1L）：蛋白胨10.0g 酵母粉5.0g Nacl 10.0g 去离子水1000ml pH 7.0
无机盐培养基(1L)：(NH4)2SO4 2.00g K2HPO43H2O 2.00g NaH2PO4H2O 0.60g MgCl2 0.50g NaCl 1.00g CaCl2 0.02g 去离子水1000ml NA培养基(1L):葡萄糖10g，蛋白胨5g，酵母粉0.5g，牛肉膏3g，琼脂20g，pH7.0
1．2 方法
1.2.1 拮抗菌的分离筛选、鉴定及生化性质研究
1.2.1.1 拮抗菌株的分离
1.番茄青枯菌菌悬液的制备
将番茄青枯菌接入到50mL NA液体培养液中，于30℃条件下170rpm振荡培养48小时，调节青枯菌悬液浓度至1×108CFU ml1。
病原菌平板的准备
将制备好的0.1ml菌悬液均匀涂布到NA平板上，然后放到超净台中充分晾干。
拮抗菌株的分离
采用稀释平板法，将土样稀释成不同稀释度的土壤溶液，用无菌吸管分别吸取0.1ml不同稀释度的土壤溶液涂布在病原菌平板上，放置在培养箱内培养24h，观察菌落的生长情况和拮抗圈大小。
对峙实验
用灭菌牙签将筛选的菌株从LB平板上点到病原菌平板中央。在30℃恒温培养箱中培养48h后，测量抑菌圈直径。
1.2.1.2 拮抗菌株的菌落形态观察
将所筛选的菌株在LB平板上划线后，于30℃培养，培养48h后观察菌落形态。制备细胞涂片，在显微镜下观察菌体形态。
1.2.1.3 拮抗菌株对抗生素敏感性试验
挑选拮抗菌单菌落，接种于LB液体培养液中，于30℃条件下，170rpm振荡培养24h，然后取0.1ml培养液涂布于LB平板上，然后将含有抗生素的纸片置于培养基上，继续培养24h。最后根据抑菌环的大小，鉴定细菌对抗生素的敏感性。
1.2.2 拮抗菌株的16S rRNA基因序列的分析
1.2.2.1 菌株基因组DNA的提取
提取菌株细胞总DNA的方法参照试剂盒说明书进行操作。
1.2.2.2 拮抗菌株的16S rRNA基因序列的PCR扩增
采用16S rRNA基因的通用引物：16S F:5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’；16S R：5’TACCTTGTTACGACTT3’对拮抗菌株进行16S rRNA基因序列进行扩增。
PCR扩增采用25μl反应体系：Mg2+2.5μl，10×buffer2.5μl，dNTP(10mmolL1）2μl，上下游引物（10mmolL1）各1μl，模板DNA 1μl，Taq酶（5UL1）0.3μl，ddH2014.7μl,总体系为25μl。
PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，53℃退火1min，72℃延伸2min，72℃保持10min，共循环35次。
1.2.2.3 PCR扩增产物的纯化
采用凝胶纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化，具体操作按照试剂盒相应说明书。纯化的PCR产物于20℃保存备用。
1.2.2.4 拮抗菌株的16S rRNA基因序列的测序
测序由南京伯津生物技术有限公司测序部完成。
1.2.3 不同培养条件对拮抗菌生长的影响
1.2.3.1 培养温度对拮抗菌生长的影响
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1青枯菌株2
1.2.1分离土壤2
1.2.1培养基2
1.2方法 2
1.2.1拮抗菌的分离筛选、鉴定及生化性质研究2
1.2.2拮抗菌株的16S rRNA基因序列的分析2
1.2.3不同培养条件下拮抗菌生长的测定3
1.2.4番茄根系分泌物对拮抗菌生长的影响3
2结果与分析3
2.1拮抗菌株的分筛选3
2.2拮抗菌株的形态特性4
2.3拮抗菌株的抗生素敏感性4
2.4拮抗菌株的16S rRNA基因序列分析5
2.5不同培养条件对拮抗菌生长的影响5
2.6番茄根系分泌物对拮抗菌生长的影响8
3讨论 8
致谢9
参考文献9
番茄青枯病拮抗菌的筛选及生物学特性研究
引言
引言
番茄是全世界栽培最为广泛的果菜之一，我国为主要生产国之一，全国各地普遍种植[1]。但番茄连作时，土传病害十分严重，其中，番茄青枯病是重要的病害之一，该病是由茄科劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）导致的一种毁灭性土传细菌病害[2]，发病率一般高达80%以上，严重时造成绝收，给番茄生产带来
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
极大的威胁[3]。使用生防菌防治土传病害，已成为植物病害生物防治工作的研究热点[4]。生防菌的定殖能力是生防菌发挥作用的重要因素[5]。在本研究中把生长速度和竞争力作为首要筛选标准，筛选快速利用番茄根系分泌物和根组织的菌株（在短时间内快速生长的必定是竞争力强的菌株），再从中筛选对病原菌具备拮抗能力的菌株[6]。在此基础上研究其生物学性状，并验证对青枯病的防效及对番茄根系微生物区系的影响，这对于控制番茄青枯病，促进温室蔬菜的健康发展，提高经济效益具有重要的指导意义。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 青枯菌株
番茄青枯病病原菌由实验室提供，经致病性试验鉴定，该菌株为强致病力菌株
1．1．2 分离土壤
用于分离拮抗菌的土壤为取自健康番茄植株的根际土壤
1．1．3 培养基
LB培养基（1L）：蛋白胨10.0g 酵母粉5.0g Nacl 10.0g 去离子水1000ml pH 7.0
无机盐培养基(1L)：(NH4)2SO4 2.00g K2HPO43H2O 2.00g NaH2PO4H2O 0.60g MgCl2 0.50g NaCl 1.00g CaCl2 0.02g 去离子水1000ml NA培养基(1L):葡萄糖10g，蛋白胨5g，酵母粉0.5g，牛肉膏3g，琼脂20g，pH7.0
1．2 方法
1.2.1 拮抗菌的分离筛选、鉴定及生化性质研究
1.2.1.1 拮抗菌株的分离
1.番茄青枯菌菌悬液的制备
将番茄青枯菌接入到50mL NA液体培养液中，于30℃条件下170rpm振荡培养48小时，调节青枯菌悬液浓度至1×108CFU ml1。
病原菌平板的准备
将制备好的0.1ml菌悬液均匀涂布到NA平板上，然后放到超净台中充分晾干。
拮抗菌株的分离
采用稀释平板法，将土样稀释成不同稀释度的土壤溶液，用无菌吸管分别吸取0.1ml不同稀释度的土壤溶液涂布在病原菌平板上，放置在培养箱内培养24h，观察菌落的生长情况和拮抗圈大小。
对峙实验
用灭菌牙签将筛选的菌株从LB平板上点到病原菌平板中央。在30℃恒温培养箱中培养48h后，测量抑菌圈直径。
1.2.1.2 拮抗菌株的菌落形态观察
将所筛选的菌株在LB平板上划线后，于30℃培养，培养48h后观察菌落形态。制备细胞涂片，在显微镜下观察菌体形态。
1.2.1.3 拮抗菌株对抗生素敏感性试验
挑选拮抗菌单菌落，接种于LB液体培养液中，于30℃条件下，170rpm振荡培养24h，然后取0.1ml培养液涂布于LB平板上，然后将含有抗生素的纸片置于培养基上，继续培养24h。最后根据抑菌环的大小，鉴定细菌对抗生素的敏感性。
1.2.2 拮抗菌株的16S rRNA基因序列的分析
1.2.2.1 菌株基因组DNA的提取
提取菌株细胞总DNA的方法参照试剂盒说明书进行操作。
1.2.2.2 拮抗菌株的16S rRNA基因序列的PCR扩增
采用16S rRNA基因的通用引物：16S F:5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’；16S R：5’TACCTTGTTACGACTT3’对拮抗菌株进行16S rRNA基因序列进行扩增。
PCR扩增采用25μl反应体系：Mg2+2.5μl，10×buffer2.5μl，dNTP(10mmolL1）2μl，上下游引物（10mmolL1）各1μl，模板DNA 1μl，Taq酶（5UL1）0.3μl，ddH2014.7μl,总体系为25μl。
PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，53℃退火1min，72℃延伸2min，72℃保持10min，共循环35次。
1.2.2.3 PCR扩增产物的纯化
采用凝胶纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化，具体操作按照试剂盒相应说明书。纯化的PCR产物于20℃保存备用。
1.2.2.4 拮抗菌株的16S rRNA基因序列的测序
测序由南京伯津生物技术有限公司测序部完成。
1.2.3 不同培养条件对拮抗菌生长的影响
1.2.3.1 培养温度对拮抗菌生长的影响
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