水稻耐铵机制中的作用机理研究
摘要：水稻生长在淹水土壤中，能够适应铵态氮营养，而一般的旱地作物在铵态氮营养下容易中毒。由于根系吸收铵态氮以后会分泌质子，造成根际强烈酸化，对一般的植物而言，会导致根系生长发育受到影响，养分吸收也会受到抑制。因此我们推测，能够在铵态氮营养下生长的植物应该具有耐酸的特性。本实验用葡聚糖两相分离法提取了在铵态氮营养和硝态氮营养下的水稻苗期根系细胞膜，并检测细胞膜质子泵的活性，以期阐明水稻根系细胞质膜质子泵是否对不同氮素营养下根际pH的改变产生了响应。实验结果表明：（1）细胞膜蛋白纯度接近95%；（2）铵态氮营养的水稻根系细胞膜质子泵活性和酶动力学参数均比硝态氮营养处理下高。上述结果说明铵态氮营养下水稻根系细胞膜活性高于硝态氮营养是其适应根际酸化的一种重要机制，也是其对铵态氮营养的一种适应机制。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法 2
1.1 水稻培养 2
1.2 测定方法 2
1.2.1 营养液pH变化 2
1.2.2 植株中铵硝含量的测定 3
1.2.3 细胞膜分离 3
1.2.4 蛋白含量测定 3
1.2.5 细胞膜质子泵水解活性的测定3
2 结果与分析3
2.1 硝铵营养下根际pH变化3
2.2 植株体内铵硝含量3
2.3 质膜方法可靠性检测4
2.4 铵硝营养下根系细胞膜质子泵水解活性的比较5
2.5 铵硝营养对质子泵酶动力学参数的影响5
2.6 质子泵免杂交测定6
3 讨论 7
致谢8
参考文献8
水稻耐铵机制中的作用机理研究
引言
植物能够吸收的无机态氮源主要是铵态氮和硝态氮。但的氮肥的形态主要是以铵态氮为主，这是因为铵态氮肥成本低，而硝态氮肥也是从铵态氮再加工后生产出来的，价格更高。铵态氮施入土壤后，在旱地土壤中，由于通气状况好，硝化细菌生长活跃，因此铵态氮会被这些硝化细菌氧化成硝态氮，但是在土壤淹水或者土壤酸性比较强的情况下，硝化作
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用受抑制，而且铵态氮带正电荷，可以被土壤胶体所吸附，容易在土壤中积累还不易损失[1]。所有的植物都能利用这两种形态的氮源，但植物所生长的土壤性状、温湿度、氧供应等情况决定了不同种类即使是同种植物也会存在吸收的主要氮源各不相同的情况，使植物表现出对铵态氮或硝态氮的特异喜好[2]。而我国主要粮食作物之一的水稻，由于长期生长在水田里，是典型的喜铵植物，即使在供应全铵的环境中也不会产生铵毒害的情况，而其他作物在全铵营养时则会表现出铵中毒的现象[35]。铵中毒的原因主要包括铵离子（NH4+）需要在细胞中迅速同化，大量的铵同化所需要的碳架不足时就会导致铵中毒[6]，这是由于植物地上部向根系运输碳源受限制，所以在外加碳源的时可以缓解植物铵中毒[7－8]。有研究认为这是地上部分光合磷酸化过程与氮代谢过程的不协调[9]，但尚无明确的结论[10]。根系吸收大量铵离子会与其他阳离子竞争，导致作物对钾钙镁等离子的吸收受到抑制。通常不同植物铵中毒的情况不尽相同。但是一个普遍的现象是，铵吸收后导致的根际酸化，与植物铵中毒紧密相关，很可能是一个重要诱因[1113]。
根系对铵的吸收存在低亲和性和高亲和性两种系统，说明氨转运包括被动和主动两种运输方式。研究已经证明在外界高浓度铵态氮供应下，NH3可直接通过细胞膜上的水通道蛋白进入根细胞[1415],因此铵离子要在细胞外留下一个氢离子才能进入细胞。在低浓度铵态氨营养下，铵离子（NH4+）是通过细胞膜上的铵转运蛋白单向运输进入根系细胞，因此受细胞跨膜电化学势的控制[1617]。在铵吸收以后，会引起膜电位去极化，导致氢离子的排出，因此，研究发现，很多淹水植物若单以铵态氮为氮源，其根际pH值经常在3以下[1819]。
水稻根系细胞质膜上的质子泵（H +pump）或H+ ATPase通过水解ATP产生能量，将细胞质中的质子（H+）泵出细胞，从而改变细胞两侧质子浓度梯度和电化学势，以此形成电化学势差驱动各种物质进行跨膜运输[2021]。此外它还具有一些重要的生理功能，把细胞代谢过程中产生的酸 (H+) 排泄到细胞外。从理论上讲，细胞膜质子泵在理论上可以无限地将H+排到根际中去。因此，本实验主要研究了水稻在铵态氮营养与硝态内容营养下质子泵活性的差异，为探明质子泵在植物耐铵中的作用机制寻找答案。
1 材料与方法
1．1水稻培养
供试水稻品种为南光（Oryza sativa L. Japonica ssp. cv. Nanguang）。
种子用双氧水消毒后在清水中浸泡一天，置于 25℃恒温光照培养箱中发芽，当幼苗立针时移到温室中继续培养，2叶1心时移栽入5 L的塑料桶中水培，共种植36株水稻，每隔三天换一次营养液，营养液采用国际水稻研究所（IRRI）常规营养液配方。实验设两个处理，供N形态为40 mg/L NH4+N，以(NH4)2SO4配入；40 mg/L NO3N，以Ca(NO3)24H2O配入。独立试验重复3次。
1.2 测定方法
1.2.1营养液pH变化 换营养液后，每12 h测定pH。
1.2.2 植株中铵硝含量测定 根据李合生[22]的方法，称取鲜样1 g左右于研钵中匀浆，沸水浴30 min，定容后加活性碳脱色，过滤，最后用流动注射分析仪（AutoAmalyzers 3, Bran + Luebbe GmbH, Germany）测定N含量。
1.2.4细胞膜分离 参照Yan[23]的方法。称根系20 g左右，加入4倍研磨液（含50 mmolL1 BTP，pH 7.8）、2 mmolL1 EGTA、0.5%(w/v) BSA、 250 mmolL1蔗糖、10%甘油、5 mmolL1 2巯基乙醇、2 mmolL1 DTT、1 mmolL1 PMSF，匀浆后11 500 g离心10 min，上清液再次87 000 g下离心35 min，取沉淀用6 mL磷酸缓冲液悬浮，加入由右旋糖苷（Dextran）T500和聚乙二醇（PEG）3350组成的两相分离系统（6.1% ），经720 g三次离心后取上相，用BTP缓冲液稀释6倍，151 200 g下离心40 min。收集到膜蛋白，分装后速冻于80℃中保存。所用离心机为BECKMAN COULTERＯptimumTM L80 XP，转头为SW32 Ti。
1.2.5细胞膜质子泵水解活性的测定 反应体系参照Yan的方法，显色过程参照Ohnishi[25]的方法。反应体系体积为0.50mL，含有30 mM BTP/MES缓冲液，5 mM MgSO4，50 mM KCl，0.02% (w/v) Brij 58（Sigma），5 mM Na2ATP。加入30 μL膜蛋白（蛋白含量12 μg）30℃保温30 min；加入中止液2.5 mL，2 min后再加入显色液0.5 mL，30 min后720 nm比色测定。活性根据单位时间内每毫克膜蛋白释放出的磷含量计算。
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法 2
1.1 水稻培养 2
1.2 测定方法 2
1.2.1 营养液pH变化 2
1.2.2 植株中铵硝含量的测定 3
1.2.3 细胞膜分离 3
1.2.4 蛋白含量测定 3
1.2.5 细胞膜质子泵水解活性的测定3
2 结果与分析3
2.1 硝铵营养下根际pH变化3
2.2 植株体内铵硝含量3
2.3 质膜方法可靠性检测4
2.4 铵硝营养下根系细胞膜质子泵水解活性的比较5
2.5 铵硝营养对质子泵酶动力学参数的影响5
2.6 质子泵免杂交测定6
3 讨论 7
致谢8
参考文献8
水稻耐铵机制中的作用机理研究
引言
植物能够吸收的无机态氮源主要是铵态氮和硝态氮。但的氮肥的形态主要是以铵态氮为主，这是因为铵态氮肥成本低，而硝态氮肥也是从铵态氮再加工后生产出来的，价格更高。铵态氮施入土壤后，在旱地土壤中，由于通气状况好，硝化细菌生长活跃，因此铵态氮会被这些硝化细菌氧化成硝态氮，但是在土壤淹水或者土壤酸性比较强的情况下，硝化作
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用受抑制，而且铵态氮带正电荷，可以被土壤胶体所吸附，容易在土壤中积累还不易损失[1]。所有的植物都能利用这两种形态的氮源，但植物所生长的土壤性状、温湿度、氧供应等情况决定了不同种类即使是同种植物也会存在吸收的主要氮源各不相同的情况，使植物表现出对铵态氮或硝态氮的特异喜好[2]。而我国主要粮食作物之一的水稻，由于长期生长在水田里，是典型的喜铵植物，即使在供应全铵的环境中也不会产生铵毒害的情况，而其他作物在全铵营养时则会表现出铵中毒的现象[35]。铵中毒的原因主要包括铵离子（NH4+）需要在细胞中迅速同化，大量的铵同化所需要的碳架不足时就会导致铵中毒[6]，这是由于植物地上部向根系运输碳源受限制，所以在外加碳源的时可以缓解植物铵中毒[7－8]。有研究认为这是地上部分光合磷酸化过程与氮代谢过程的不协调[9]，但尚无明确的结论[10]。根系吸收大量铵离子会与其他阳离子竞争，导致作物对钾钙镁等离子的吸收受到抑制。通常不同植物铵中毒的情况不尽相同。但是一个普遍的现象是，铵吸收后导致的根际酸化，与植物铵中毒紧密相关，很可能是一个重要诱因[1113]。
根系对铵的吸收存在低亲和性和高亲和性两种系统，说明氨转运包括被动和主动两种运输方式。研究已经证明在外界高浓度铵态氮供应下，NH3可直接通过细胞膜上的水通道蛋白进入根细胞[1415],因此铵离子要在细胞外留下一个氢离子才能进入细胞。在低浓度铵态氨营养下，铵离子（NH4+）是通过细胞膜上的铵转运蛋白单向运输进入根系细胞，因此受细胞跨膜电化学势的控制[1617]。在铵吸收以后，会引起膜电位去极化，导致氢离子的排出，因此，研究发现，很多淹水植物若单以铵态氮为氮源，其根际pH值经常在3以下[1819]。
水稻根系细胞质膜上的质子泵（H +pump）或H+ ATPase通过水解ATP产生能量，将细胞质中的质子（H+）泵出细胞，从而改变细胞两侧质子浓度梯度和电化学势，以此形成电化学势差驱动各种物质进行跨膜运输[2021]。此外它还具有一些重要的生理功能，把细胞代谢过程中产生的酸 (H+) 排泄到细胞外。从理论上讲，细胞膜质子泵在理论上可以无限地将H+排到根际中去。因此，本实验主要研究了水稻在铵态氮营养与硝态内容营养下质子泵活性的差异，为探明质子泵在植物耐铵中的作用机制寻找答案。
1 材料与方法
1．1水稻培养
供试水稻品种为南光（Oryza sativa L. Japonica ssp. cv. Nanguang）。
种子用双氧水消毒后在清水中浸泡一天，置于 25℃恒温光照培养箱中发芽，当幼苗立针时移到温室中继续培养，2叶1心时移栽入5 L的塑料桶中水培，共种植36株水稻，每隔三天换一次营养液，营养液采用国际水稻研究所（IRRI）常规营养液配方。实验设两个处理，供N形态为40 mg/L NH4+N，以(NH4)2SO4配入；40 mg/L NO3N，以Ca(NO3)24H2O配入。独立试验重复3次。
1.2 测定方法
1.2.1营养液pH变化 换营养液后，每12 h测定pH。
1.2.2 植株中铵硝含量测定 根据李合生[22]的方法，称取鲜样1 g左右于研钵中匀浆，沸水浴30 min，定容后加活性碳脱色，过滤，最后用流动注射分析仪（AutoAmalyzers 3, Bran + Luebbe GmbH, Germany）测定N含量。
1.2.4细胞膜分离 参照Yan[23]的方法。称根系20 g左右，加入4倍研磨液（含50 mmolL1 BTP，pH 7.8）、2 mmolL1 EGTA、0.5%(w/v) BSA、 250 mmolL1蔗糖、10%甘油、5 mmolL1 2巯基乙醇、2 mmolL1 DTT、1 mmolL1 PMSF，匀浆后11 500 g离心10 min，上清液再次87 000 g下离心35 min，取沉淀用6 mL磷酸缓冲液悬浮，加入由右旋糖苷（Dextran）T500和聚乙二醇（PEG）3350组成的两相分离系统（6.1% ），经720 g三次离心后取上相，用BTP缓冲液稀释6倍，151 200 g下离心40 min。收集到膜蛋白，分装后速冻于80℃中保存。所用离心机为BECKMAN COULTERＯptimumTM L80 XP，转头为SW32 Ti。
1.2.5细胞膜质子泵水解活性的测定 反应体系参照Yan的方法，显色过程参照Ohnishi[25]的方法。反应体系体积为0.50mL，含有30 mM BTP/MES缓冲液，5 mM MgSO4，50 mM KCl，0.02% (w/v) Brij 58（Sigma），5 mM Na2ATP。加入30 μL膜蛋白（蛋白含量12 μg）30℃保温30 min；加入中止液2.5 mL，2 min后再加入显色液0.5 mL，30 min后720 nm比色测定。活性根据单位时间内每毫克膜蛋白释放出的磷含量计算。
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